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花卉体细胞胚发生的研究进展
日期:2012-02-23 作者:于子婷 黄丛林 罗昌 张秀海 吴忠义 程曦 来源:《湖北农业科学》.-2011,(20).-4112-4114 点击:
 

    植物体细胞胚发生(Somatic embryogenesis)是指体细胞在特定条件下,未经性细胞融合而通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的形态发生过程。经体细胞胚发生过程形成的类似合子胚的结构称为胚状体或体细胞胚。1958年,Steward等首次从胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa DC.)悬浮细胞中获得了体细胞胚,之后的50多年里,对体细胞胚的研究取得了很大的进展。与传统的器官发生不同,体细胞胚在发生的早期阶段就有两极性,即胚根与胚芽,而与母体细胞或外植体的维管束无直接联系,说明胚状体一开始就是一个完整植株的雏形,可以通过类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。文章综述了植物体细胞胚发生的几个阶段性过程,比较了影响体细胞胚发生的内环境因素,为进一步研究花卉体细胞胚高效再生体系的建立提供参考。

1  体细胞胚的发生过程

    一般植物体细胞胚的发生包括胚性组织的诱导与扩增、体细胞胚的成熟、体细胞胚萌发与植株转化3个基本过程。   

    胚性组织的诱导与扩增(即胚性细胞团的分裂)3种不同方式,一是由多个致密细胞组成的胚胎头部细胞产生多次分裂,二是由大液泡的胚柄细胞产生分裂,三是由单个胚性细胞进行分裂。这一时期的外植体多数需要在暗培养条件下进行,可以得到半透明的未成熟胚性组织。

    体细胞胚的成熟是指从体细胞胚发生到萌发前的干化这段时期,体细胞胚成熟需要满足形态上和生理上的共同成熟才算完全成熟;因为只有形态学上的成熟还不能保证胚性细胞具有胚胎发生的能力,只有形态上和生理上均达到成熟的体细胞胚才有利于后期的萌发和植株转化。这一阶段会有大量的生化产物积累、可为体细胞胚发生提供营养保障;在胚胎发生早期就有淀粉的积累,随着胚胎的发育,淀粉的含量也不断增加,到了子叶胚阶段,淀粉的积累才逐渐降低;蛋白质及脂类的积累则伴随体细胞胚的发生从基部到底部呈梯度变化。

    体细胞胚萌发通常仅指体细胞胚根的伸长,但胚根伸长之后并不一定伴随茎的伸长。因此,体细胞胚萌发成功不能代表植株再生成功。

    植株转化是指具有功能的根和茎的生长,植株成熟后与母体分离,产生后期可成活的小植株。成熟的体细胞胚在无植物激素、低蔗糖浓度的培养基中萌发和转化成小植株,当植株达到一定的高度,可以进行温室驯化和大田移栽。

2  影响花卉体细胞胚发生的因素

    影响花卉体细胞胚发生的因素有很多,主要包括两个方面的因素,内部因素和外部因素。内部因素主要指植物种类、外植体取材部位、细胞渗透压等;外部因素主要是培养基以及附加的植物激素等成分和培养条件,如光照、温度、培养方式等。

2.1  渗透压调节对花卉体细胞胚发生的影响

    低渗透压是合子胚发生的一个重要的内环境因素,胚乳不仅为胚的发生提供营养物质,同时创造了一个低渗透压的环境。以促进胚的发育。早期胚胎发生研究中使用蔗糖、甘露醇作为质壁分离剂来降低细胞的渗透压,但近年来的研究发现,二者不仅可以穿过质膜被细胞吸收,恢复细胞渗透压;同时高浓度的蔗糖和甘露醇对细胞也有一定的毒害作用。PEG 4000作为一种不易透过质膜的大分子物质在花卉体细胞胚的研究中被广泛当作周围质壁分离剂使用,它不仅可以降低细胞的渗透压,同时能够促进胶凝剂的积累。ABA是在合子胚干燥和休眠的过程中主要的调控激素,胚性细胞虽然没有经历干燥、休眠过程,但却能合成和积累ABA,并且在胡萝卜体细胞胚发育中,胚性细胞比非胚性细胞有更高的ABA含量,ABAPEG组合使用可以更好地促进体细胞胚的发生。胚性细胞经过低渗处理后,还要经过适当的干燥处理才能发育成小植株、因为在合子胚发育的后期,失去水分是萌发的关键步骤。研究发现,对云杉(Picea asperata Mast.)胚性细胞进行部分干燥处理,可以提高胚性细胞的发育程度,减少分化时间,同时还能增加胚性细胞向两极分化的能力。

2.2  植物激素对花卉体细胞胚发生的影响

    植物激素在植物体细胞胚发生中起着重要的作用。57.7%的双子叶植物以及所有的单子叶植物在其体细胞胚发生的诱导阶段都使用24-D,并且单子叶植物要求2,4-D的浓度较高,0.55.0mg/L,通常使用2.0mg/L;而双子叶植物的浓度相对较低,为0.021.00mg/L,通常使用0.10mg/L。一般而言,植物激素诱导体细胞胚发生的胚活性大小为2,4-D>NAA>IBA>IAA。在研究植物愈伤组织合成生物碱的过程中,发现光照可以促进长春花[Catharanthus roses (L.)]生物碱的生物合成,同时刺激质体的形成及过氧化物酶活性,然而2,4-D抑制所有吲哚生物碱及过氧化物酶的活性。另有研究表明,胚性愈伤组织中抗氧化酶的活性较高,说明胚性愈伤组织的适应性、抗逆性强于非胚性愈伤组织,能够为胚性细胞的分化创造有利条件,因此在体细胞胚发生后期,适当降低2.4-D的浓度是必要的。TDZZ是一种人工合成的苯基脲类化合物,最开始被用作棉花(Gossypium spp.)的脱叶剂。TDZ在体细胞胚培养中能够增强组织中催化细胞分裂素向细胞分裂素核苷转变的酶活性、也可以抑制细胞分裂素氧化酶对内源玉米素类物质的分解作用,说明TDZ有很强的细胞分裂作用,而且TDZ具有IAA6-BA的双重作用功能。TDZ在体细胞胚发生的过程中,可以有两种方式发生作用,在间接体细胞胚发生过程中,通常在愈伤组织诱导阶段加入TDZ;在直接体细胞胚发生过程中,通常在体细胞胚诱导阶段加入TDZTDZ对不同植物体细胞胚发生的影响是不同的,对某些花卉具有高效的体细胞胚诱导作用,如谭鹏鹏在蝴蝶兰[Phalaenopsis amabilis(L.)Bl.]的体细胞胚诱导中,仅加入TDZ一种化合物就能使体细胞胚的诱导率达到68.3%;而有的花卉则需要TDZ与其他激素配合使用才能提高体细胞胚的诱导率。

    不同花卉所需激素的配比不同,不同时期所使用激素的浓度也不相同,虽然对体细胞胚发生中内源激素的报道有很多,但不同的花卉在进行体细胞胚诱导的过程中对激素的浓度配比仍然需要进行重新的摸索。如长寿花(Kalanchoe blossfeldiana Poell.)用叶片做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为NAA 1.0mg/L+6-BA1.0 mg/L;白鹤芋[Spathiphyllum floribundum (Lind. et. Andre) N.E.Br.]用雄蕊花丝做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为TDZ 0.05mg/LNAA 1.50mg/L6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L;龙牙百合(Lilium brouniivar. viridulum Baker)用鳞片做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0mg/L;地被菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)用叶片做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为IBA 1.5 mg/L+BA 0.5mg/LKT 2.0 mg/L+2.4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;铁线莲(Glematisflorida Thunb.)用茎尖做外植体进行体细胞胚培养时.激素配比为TDZ 0.8mg/L+NAA0.5mg/L;多花蔷薇(Rosa multiflora Thunb.)用假珠芽做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为TDZ 2.0 mg/L+GA30.1mg/L;紫斑牡丹[Paeonia suffruticosa var. papaveracea(Andr.)Kerner]用种胚做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为BPA 0.1 mg/LCH 600.0mg/L+硝酸银10.0mg/L;唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort)用球茎芽做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为2,4-D 1.0mg/L+TDZ 0.2mg/L;蝴蝶兰用茎段做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为TDZ l.5mg/L;梅花[Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.]用子叶做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为NAA 1.0mg/L+IBA1.0mg/L;一品红(Euphorbia pulcherrima Willd)用苞片做外植体进行体细胞胚培养时,激素配比为2.4-D1.0 mg/L+6-BA 0.5mg/L。从这些研究中不难看出,2,4-DTDZ是花卉体细胞胚研究中使用较多的两种激素(1)

3  花卉体细胞胚发生的应用前景

3.1  花卉体细胞胚发生在胚产量及遗传稳定性方面的应用

    传统的器官发生,要经过脱分化过程,并且很多花卉在脱分化后的愈伤组织不能正常再分化,而体细胞胚的发生与合子胚发生具有相类似的过程,通过与合子胚发生相似的途径(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶期胚阶段)形成胚状体,从而发育成完整的植株,这就保证了遗传的稳定性,同时体细胞胚的直接发生比间接发生需要的时间短,细胞发生无性系变异的可能性较小,遗传会更加稳定。研究发现单个外植体上可以产生多个体细胞胚,如多花蔷薇平均每个外植体可以产生6.5个体细胞胚,在梅花,牡丹及多花蔷薇研究中都有次级体细胞胚的出现,这不仅增加了体细胞胚的数量,同时能为种质资源保存提供有利的条件。

3.2  花卉体细胞胚在转基因育种方面的应用

    近年来,通过分子技术育种方式改良花卉品质出现了很多新的方法,其对花卉的花色、花期、花型等的改良起到了积极的促进作用。目前国内研究转基因花卉多以器官发生水平来建立再生体系;而国外以体细胞胚为受体的转基因技术已经较为成熟,并走向了市场,产生了显著的经济效益。以体细胞胚为受体可以发挥其单细胞起源、高产、遗传稳定等的优势,能够满足转基因花卉的大规模开发及商业化生产,具有广阔的发展前景。

    作者单位:(1.首都师范大学生命科学学院,北京 1000482.北京市农林科学院农业生物技术研究中心,北京 100097)

    文章采集:caisy

    注明:国家科技支撑计划项目(2009BAD8B04);北京市科学技术计划项目(209050600630906

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