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香菇的分子生物学技术研究进展
日期:2012-03-21 作者:姚强 刘岩 宫志远 高兴喜 韩建东 任鹏飞 万鲁长 任海霞 张雪梅 李瑾 曲玲 来源:《中国食用菌》.-2011,(6).-3-6 点击:
 

    香菇(Lentinus edodes)又名香菌、花菇、香蕈,属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属,是一种食药同源的食物,具有很高的营养、药用和保健价值,其中的香菇多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染等生物活性而受到广泛的关注,是研究木质纤维素降解的重要模型,具有广阔的国内国际市场,潜力巨大。随着分子生物学技术在食用菌研究上的活跃应用,对香菇的研究开始集中在其遗传信息和调控上,为改良栽培菌株提供了有力的手段。本文就香菇的遗传转化、基因克隆、分子标记和基因组学的研究情况进行了阐述。

1  遗传转化

1.1  PEG

    PEG法主要是依靠PEG使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥,促进细胞的接触和融合或者干扰细胞间的识别而有利于外源DNA的识别。1991年世界上第1次报道了食用菌中使PEC法成功遗传转化的例子,是Challen MP等利用PEG法把外源DNA导入双孢蘑菇受体菌的原生质体内获得转化子。之后孙丽等利用PEG法实现了表达载体D30l-bGl对香菇原生质体的转化,得到了抗除草剂和有GUS活性的转化菌株。闫培生等将携有潮霉素抗药性基因的质粒载体导入香菇原生质体内,获得了抗性转化子,但转化率较低,每微克DNA仅有0.5个转化子。PEG法虽然操作简单,重复性好,无需昂贵的设备,但是原生质体的浓度、PEG以及质粒DNA的用量对转化效果都有一定影响,转化效率低,一般仅为10-510-6

1.2  电激法

    电激法是通过高乐电脉冲作用,在原生质体膜做可以恢复的击穿引导外源DNA的摄入,经过发展改良后可直接在带壁的细胞组织上打孔。Rover JC等第1次成功利用电激法把二氢乳清酸脱氢酶基因URA l转入同源的杨树菇营养缺陷型突变型菌株ural菌株中。在1997年贾建航等利用电激法将香菇的DNA导入平菇,并且获得可以出菇的转化子。最近Kuo CY以香菇孢子和菌丝体为实验材料使GUS基因成功的在香菇中表达,这种方法避免了原生质体制备的麻烦,转化效率在每微克DNA 30个~150个转化子。电激法使用范围更为广泛,原生质体、菌丝体、完整的细胞均可使用电激法,需要的DNA量也少的多,相应的所使用的仪器昂贵,电击对转化子的损伤较大。

1.3  限制性内切酶介导整合法

    REMI方法依靠限制性内切酶在核内对特异的酶切位点活体切断染色体DNA,产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制性内切酶切断的线性化的质粒DNA相接。Sato T运用REMI方法首次成功地将重组载体pLCl-hph转化进香菇,与普通PEG法相比较其转化效率提高了10倍。Hirano T等构建了含香菇GPD启动子的载体pLG-hph,利用REMI方法成功地使hph基因在香菇中得到表达。Irie T等运用REMI法使香菇具有了萎锈灵抗性,其转化效率提高了大约2倍。限制性内切酶介导整合法很大幅度地提高了转化率,但是必须使用适宜的酶和酶浓度,而且易引起突变产生假阳性。

2  基因克隆及分离

    食用菌在基因组构建成功后有许多基因被克隆和测序,对香菇基因的克隆主要集中在原基形成和子实体生长有关的基因上。Ng WL等从香菇中克隆了2个疏水蛋白基因Le.hydlLe. hyd2,并证明这2个基因在香菇的生长过程中表达存在区别。Shinya K从香菇子实体的cDNA文库中克隆了基因Le.rnr2c,使之表达后发现该基因在子实层体中转录活性最强。Carol YYS利用RAP-PCR的方法获得了组氨酸蛋白激酶Le.nikl基因的全长,发现其与链孢霉的nikl基因有很高的同源性,在香菇的原基形成和子实体成熟阶段表达水平最高。Carol YYS等获得分裂原活化蛋白激酶基因LeMAPK,着重研究了该基因和其分子伴侣le.DRMIO的信息传导途径,证明他们在香菇子实体形成和生长过程中有重要作用。Miyazakl Y 分离了100个和子实体生长有关的基因并从中发现类成束蛋白Le.flplRT-PCR分析后发现Le.flpl在原基和成熟子实体中特异的表达。除此之外,香菇中很多具有特殊功能的基因也被克隆。Ishizaki T等从香菇中分离得到了在子实体发育的后期、菌褶中转录活性较高的基因Le. paa,该基因编码磷酸化酶的调节亚基A的同源物。Hiroakj S获得了香菇的phrB基因,并将其定位在香菇酪氨酸酶基因的启动子区域,通过曝光量表明PHRB能够调节香菇酪氨酸酶基因Le.tyr的表达。

3  香菇的分子标记

    广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质,主要用于反映物种个体间内在的差异性,是DNA水平遗传变异的直接反映,越来越多的分子标记技术在香菇中进行应用,对香菇的种群鉴定和优良品种选育都具有十分重要的意义。

3.1  RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA )

    Williams等在上世纪80年代末、90年代初发展了RAPD分子标记技术,开创了直接利用DNA分子标记遗传多态性的新阶段。RAPD是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,利用脱氧桉苷酸序列随机的作为PCR的引物,对基因组进行扩增而获得一系列长度不同的多态性DNA片段。Kwan HS对香菇菌株L-542个亲本及分离的32个单孢进行RAPD分析并构建了RAPD连锁图潜。龚利娟对32个中国香菇栽培品种和2个野生品种进行RAPD标记发现,这34个菌株间遗传相关性极高,表明这些中国栽培菌株间的遗传背景单一 。邓旺秋对广东省5个香菇栽培菌株或其衍生菌株进行RAPD分析,表明不同菌株间存在着丰富的遗传多样性。RAPD不仅能对香菇的亲缘关系和遗传差异进行研究而且能鉴定杂合子。叶明利用RAPD对香菇6个双单杂交菌株及其2个双核体进行杂交株的检测,表明RAPD能显示菌株间的遗传差异和亲缘关系。RAPD已经成为香菇商业菌株质量检测快速而有效的技术手段。

    RAPD反应受条件影响较大,稳定性和重复性相对较差,有许多因素都会影响RAPD的扩增结果。另外RAPD仅是一种显性标记,不能区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的,不能进行等位分析。

3.2  SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)

    SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的,将目标RAPD扩增的特异性片段进行克隆并对其末端测序后转换为SCAR标记,把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来,实现由非特异性分子标记到特异性标记的转化。吴学谦等获得香菇菌株162和申香10号的特异SCAR标记,能在一天时间内准确鉴定出这两种菌株的真伪。WuX运用SCAR和以SCAR标记为基硎}的多重PCR技术,能快速地将香菇目标菌株划分为不同的组群。Tanaka ARAPD转换成SCAR标记,并根据RAPD的内部序列设计了2对和接合因子A及因子B有关的引物,对PCR的条件进行了优化。Li HB3个主要的SCAR标记为基础,设计了3条引物,从23个香菇商业菌株中鉴别出目标菌株,为鉴定香菇菌株提供了陕速有效的方法。

    不同的分子标记转换成SCAR标记的成功率是不同的。RAPD扩增过程中错配几率较高,导致SCAR标记的转换成功率较低。而由SRAPISSP分子标记转换得到的SCAR标记成功率较高。

3.3   RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

    RFLP是以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术,用限制性内切酶酶切后用克隆的DNA片段做探针进行分子杂交,再通过放射性自显影技术可以检测片段长度的多态性,这样的酶与探针组合可以作为遗传标记。马富英脚对侧耳属52个菌株以及双孢蘑菇、香菇和亚侧耳各1个菌株进行了PCR-RFLP分析,结果表明RFLP能将双孢蘑菇、香菇和亚侧耳与侧耳分开。程水明利用8对引物组合对2个香菇菌株间的杂交F1代进行AFLP多态性标记,结果显示AFLP标记在该F1代群体中的多态性较高。Lo TC首次将基因组DNAAFLP与多糖糖基键的综合聚类,分析10个香菇菌株基因组和结构的相似性及不同,将这10个菌株分成3个不同的组。AFLP的效率高,分辨率高,稳定性好,同时对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高,技术费用昂贵。

3.4  ISSR(Inte-simple Sequence Repeat)

    ISSRZietkeiwitcz等于1994年发展起米的一种微卫星基础上的分子标记。以锚定的微卫星DNA为引物,在PCR反应中,锚定引物可引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。秦莲花等结合ITSISSR技术对12株香菇生产菌株,以及豹皮香菇和虎皮香菇的4个菌株进行遗传分析,可以用作香菇生产菌株鉴别,为香菇生产菌株的快速准确鉴别提供了技术依据。Zhang R使用2对引物对17个香菇菌株进行ISSR分析,将这17个菌株分成高温广温组和低温中温组两大类。王卓仁对2个香菇菌株杂交后的21个杂交子及亲本进行DNA ISSR多态性分析,同一类群的杂交子在多种农艺性状方而表现相似,这就为优良杂交后代的初步筛选提供了重要参考。王子迎利用13个引物对26个野生香菇菌株和6个栽培种,进行了ISSR遗传多样性分析,以此选择遗传距离远近不同的亲本进行组合杂交并评价了其杂种优势。ISSR引物可以在不同的物种间通用,其开发不需要获得SSR两侧的单拷贝序列,这样开发费用降低。ISSR揭示的多态性较高,检测非常方便。

3.5  SSRITS (Internal Transcribed Spacer)

    SSR广泛存在于整个真核生物的基因组中的串联重复序列,多态性高,是共显性标记。林范学根据香菇基因组EST序列设计了部分SSR引物。肖扬采用优化的香菇SSR-PCR体系应用5对引物对8个香菇菌株进行分类,将其分成两大类群,为SSR技术在香菇分子生物学研究方面奠定丁应用基础。刘春滟等根据在12184条香菇EST序列中找出的142SSR序列设计出40对引物,将其在18个香菇品种中进行检测,分析后发现,18个品种遗传相似性和以前报道的相一致。

    ITS是位于真菌核糖体DNA(rDNA)18S28S基因之间的区域片段,由于ITS区不加入成熟核糖体,在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异,显示最近的进化特征。杨永彬扩增出13个福建袋栽香菇菌株的ITS序列,并根据该序列特征及ITS区的差异性,设计出针对2个不同菌株进行PCR检测的特异引物探针。

4  香菇基因组研究

    目前许多真菌的基因组已经已知,食用菌中平菇和双孢蘑菇的基因组已经被测序,关海山等对香菇基因组中40Mb的片段进行了测序,并利用生物信息学对序列中的功能基因进行了比较和分析,同时注释了各种代谢和信号通路,从香菇全基因组的角度建立调控网络。

    此外1991Adams提出的表达序列标签(EST)也成为研究香菇基因组学的重要手段,EST指的是长约150bp500bp的基因表达序列片段,根据EST可以大致知道有多少不同的基因在一定的物种中表达;也可以通过比较EST来发现基因组中内含子的位点。以EST为基础发展起来的EST技术是将mRNA转录成cDNA,对其35端进行一步法测序,将所获序列与基因数据库已知序列比较。从NCBl EST数据库中搜索发现目前香菇的FST数据有20647,主要来自于成熟子实体。Takumi Suizu等以香菇中1031EST来检验基因的表达,发现疏水蛋白基因含有的EST最多,即它们在香菇中表达量最高,其次是磷脂酰丝氨酸脱羧酶和甲酸脱氧酶,此外还注意到2个和RNAi途径有关的重要基因argonaute和依赖RNARNA聚合酶。在这些EST中有53个和香菇中已经报道的序列相同,有433个和其它物种中已报道的蛋白序列有显著相似性。

5  展望

    分子生物学技术在食用菌上的应用开始的较晚,但是已经十分的活跃,在香菇上的研究也已经取得不步进展。虽然香菇的基因组没有被完全测序,但是包括与子实体发育、香味产生、纤维素降解相关的70多个不同的基因已经被发现,将已经测序的基因组序列与不同的物种比较并做更深入的分析成为日后研究的重点。此外缺少高效的表达系统和表达载体成为限制香菇转化的重要因素。相信随着基因组测序技术的日臻完善与普及,香菇基因组信息会不断的增加,更多重要的功能基因被注释,培育出更多的香菇新品种,对香菇的种质资源开发具有深远的意义。

    作者单位:(1.山东省农业科学院农业资源与环境研究所,山东 济南 2501002.青岛农业大学生命科学学院,山东 青岛 2661093.鲁东大学菌物科学与技术研究院,山东 烟台 264025)

    文章采集:caisy

    注明:山东省自然科学基金项目(Q2008D02ZR2010CL020);国家食用菌产业技术体系建设项目(编号:CARS-24);山东省农业良种工程项目(编号:2010LZ006-04)2010年省农业应用技术重大创新专项资金课题“食用菌工厂化生产关键技术研究与示范”。

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