您当前的位置:首页 >> 科技中心 >> 科技进展 >> 生物技术 >> 国内 >> 正文
适于转基因产品检测的核酸扩增技术
日期:2012-04-11 作者:刘信 来源:《中国农业科技导报》.-2011,(6).-78-81 点击:
 

    随着基因工程技术的发展,转基因技术已经广泛用于现代农业生产。全球转基因作物种植面积在过去的15年中,以13%以上的速度逐年增长。转基因技术给现代农业带来了巨大的经济效益,但公众对于转基因生物及其产品的食用和环境安全等方面的潜在风险已经有所顾虑。为了确保消费者的知情权,许多国家实施了转基因生物标识管理制度,加强转基因生物安全管理。因此,转基因生物的检测技术就显得愈发重要。

    因为DNARNA和蛋白质具有更好的稳定性,DNA已经成为转基因检测巾最主要的靶标分析对象。目前,转基因生物检测主要是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。通过对外源重组DNA的扩增,根据PCR产物判断是否为转基因产品。PCR1985年问世以来,以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用。但是,随着转基因生物产品的不断增多及各种检测目的的需要,传统PCR方法在一些方面的局限性逐渐显露出来,比如现场快速检测、对SNP位点的高灵敏度检测、多靶标复合检测及自动化检测等。与此同时,新的基于DNA分析的检测技术不断的发展,在这些方面弥补了PCR方法的不足,为转基因检测提供了新的思路,开辟了新的路径。本文主要综述了5种新型核酸扩增技术,并对其用于转基因生物检测进行了分析。

1  环介导基因恒温扩增

    2000年,Notomi等开发了环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplificationLAMP),并首次应用于核酸体外扩增。LAMP扩增依赖于具有高链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)和特别设计的两个外部引物以及内部引物,通过在等温(6065)的条件下自动循环的链置换DNA原理,进行靶序列特异性扩增。LAMP扩增方法主要优点在于:①高特异性。4条特异性引物可识别靶序列上6个不同的区域;②高效性。在1h内可获得109拷贝数的目的DNA;③高灵敏度。相对于传统PCR来说,其检测极限要高1个数量级;④仪器要求低。等温(6065)条件下扩增,无需PCR仪等专业设备;⑤结果可视化现场分析。反应完成后,加入Sybr Green I染料后,根据有无颜色反应来判定结果,无需电泳检测。

    目前,该方法已经用于转基因大豆和玉米的检测。杨立桃等基于该技术建立了2种转基因大豆、7种转基因玉米的转化体特异性检测方法,检测灵敏度可以达到0.005%,并将该方法用于日常监测工作。如果能够将该技术与DNA快速提取方法或装置相结合。将会较好的实现转基因产品的现场、快速检测,与基于蛋白质分析的侧向流动试纸相媲美。

2  基于连接酶反应的检测技术

    连接酶检测反应(ligase detection reactionLDR),是Landegren等于1988年为检出序列中的点突变而设计、发明的。其在耐高温DNA连接酶作用下,将一对与单链靶序列配对的相邻引物的切口连接起来。该技术可以有效的检测SNP位点及扩增特异性的核酸。一对引物与单链靶序列结合,如果两条引物末端碱基与靶序列完全匹配,高温连接酶将填补切口将两条引物连接起来。如果引物不能与靶序列精确结合,存在错配,缺口附近核苷酸的空间结构将发生变化,连接反应不能进行。

    连接酶链式反应(1igase chain reactionLCR)可以实现在连接反应后,变性、退火、再连接,少量的靶序列以指数形式扩增出来。LDR技术的主要优点是高特异性,但是检测灵敏度因为缺乏靶序列的扩增相对较低。LCR技术则融合了LDRPCR扩增两项技术,兼具了高特异性和高灵敏度的优点。

    目前,已有很多基于PCR预扩增的LDR检测的报道和应用,该方法(PCR/LDR)也可实现靶序列的大量扩增和特异性分析。在转基因产品检测中,有三篇利用该技术的报道,分别利用双重、多重和通用序列芯片与LDR技术联用,实现对转基因大豆、玉米等产品的检测。

3  依赖核酸序列的扩增技术

    依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplificationNASBA)是在PCR基础上发展起来的、由1对带有T7启动子序列的引物引导的连续的核酸等温扩增技术。反应在41进行,可在2h内将模板RNA扩增109倍,比常规PCR法高23个数量级,而且不需特殊仪器。NASBA反应需要二三种酶(分别是AMW逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RNAH)2条特别设计的寡核苷酸引物共同完成。NASBA技术目前被主要用于RNA的等温扩增检测,如病毒、细菌和病原微生物等。

    最近发表的一些文章表明NASBA技术方法同样适合于DNA扩增,且具备灵敏度高、动态范围宽、可进行定量分析和复合检测等优点。2008年,Dany等已经成功将NASBA技术与芯片杂交技术联用,开展转基因大豆和玉米的检测,检测灵敏度可以达到0.01%,并实现半定量分析。

4  多重置换扩增技术

    多重置换扩增技术(multiple displacement amplificationMDA)是一种可实现全基因组扩增的新方法。由Dean等于2002年发明,其原理是基于环状噬菌体滚环复制,利用phi 29 DNA聚合酶3′→5′端外切核酸酶活性和强链置换能力,以及耐核酸外切酶活性的随机引物,在等温条件下完成DNA序列的扩增。其在合成新链的同时置换模板的互补链,被置换出的互补链作为模板继续进行扩增,形成一个级联分支的放大系统,最终产生大量DNA序列。

    MDA技术的主要优点:①扩增效率高。在恒定温度(30)下能持续反应16h,且扩增产物量不易受初始模板量的影响;②扩增产物片段长。phi 29 DNA聚合酶能与DNA模板紧密,可扩增获得较长DNA产物,一般在10kh左有;③与PCR相比,对DNA的质量要求不高,且对基因组可以比较均匀扩增,无选择特异性。该技术可以有效的替代基于靶序列的PCR扩增,如果结合芯片杂交技术,则实现转基因产品的高通量、多靶标检测。

5  基于锁式探针的滚环扩增技术

    锁式探针(padlock probecircularizable oligonueleotide probeC-probe)主要由特异性序列、通用序列和Zip3个部分组成。特异性序列主要是5′端和3′端的序列,可与靶标序列特异性互补结合,在连接酶作用下使探针环化;通用序列区主要是滚环复制引物和扩增引物的结合区域,实现环状锁式探针的级联扩增;Zip序列是位于通用序列之间的与检测无关的连接序列,可进一步实现扩增产物与芯片上靶探针的杂交,检测扩增产物。如果存在检测的靶序列,锁式探针的特异性序列与靶序列结合,在连接酶的作用下两个特异性序列末端被环化成锁式探针。环化的锁式探针可以通过通用引物进行扩增,实现检测信号的放大。

    基于锁式探针的滚环扩增技术兼具了滚环复制和LDR的优点,具备高特异性、高扩增效率和等温线性扩增的优点。该方法可以与标记特异性探针的芯片相结合实现转基因生物多靶标、高通量检测。

6  展望

    目前,PCR仍然是转基因生物检测中的常规方法,简单快捷,但是由于其所需仪器精密、复合检测的局限性等缺限,在某些检测的应用中略显不足。本综述介绍的这些新技术和新方法,在某些方面可以弥补常规检测的不足之处(特别是高通量和快速检测),而且反映了检测技术发展的新趋势。当然,这些技术方法还处在研究阶段,需要进一步评估、改进和标准化才能广泛的应用到转基因检测中。

    致谢:感谢Dany Murrisset博士在本文写作过程给予的支持和帮助。

    作者单位:(农业部科技发展中心,北京 100122)

    文章采集:caisy

    注明:国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08012-003)资助。

注:本网站为公益性网站,若单位或个人不同意刊载本信息请与本站联系。
版权所有:北京市农林科学院农业科技信息研究所
电 话: 010-12396(按0转人工) 地 址:北京市海淀区板井曙光花园中路9号
京ICP证090834号 京ICP备09045065号