禾本科和豆科牧草作物不但是畜牧产业中牧草和干草的主要来源，同时在水土保持和环境保护方面发挥着重要的作用。禾本科牧草中的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)及翦股颖草(Agrostis spp.)等已被广泛地应用于各类草坪，如公园，以及高尔夫球场等运动场地的绿化；柳枝稷(Panicum virgatum)以其较高的生物量在环境领域广受重视，草芦(Phalaris arundinacea L.)作为可持续性生物能源作物可能成为矿物燃料的补给源。此外，以白三叶草(Trifolium repens)、红三叶草(Trifolium pratense)和苜蓿(Medicago satiya L.)为代表的豆科牧草不但是高品质的牧草资源，同时在生物固氮中也发挥着特殊的作用。

    以表型鉴定、选择和杂交等传统育种方法培育新牧草作物品种已有较长的历史，并将继续在牧草和畜牧产业中具有不可替代的地位。目前，以应用生物技术为代表的分子生物学为牧草作物育种开辟了新的途径，其中转基因及其基因组学生物技术成为分子育种和传统育种程序的连接纽带。转基因技术在培育抗虫、抗病和抗除草剂等作物方面已有较多报道，利用转基因技术培育具有特定目标性状的植物对研究其生理和生物化学代谢途径等有着重要的作用。继人类基因组测序计划成功后，以拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)和水稻(Oryza sativa L.)为代表的模式植物全基因组测序也已顺利完成。目前，新型禾本科模式植物二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)P. Beauv)，高粱(Sorghum bicolor Moench)的全基因组测序已经完成，豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago thuncatula Gaertn)，以及百脉根(Lotus japonicus)基因组测序正在进行，获得大量序列后结合生物信息学手段对进一步明确牧草相关物种之间的关系和基因表达将有更深入的理解，同时对牧草改良也将具有重要的实践意义。

l  基因组学在牧草育种中的应用进展

    以分子标记技术为代表的基因组学为分子育种提供了强有力的工具，近年来发展了许多应用于分子育种的技术，主要包括：DNA标记、遗传连锁图谱构建、QTL定位及其关联分析和比较基因组学等。然而与主要谷粒作物相比，牧草作物基因组学方面的研究相比较为滞后，目前多见于二倍体物种，多年生黑麦草、红三叶草等有报道。高产、优质和多抗(抗旱、耐热、抗寒、抗盐碱及抗病虫)是牧草作物育种的主要目标，这些农艺性状中许多表现连续的表型变异，且受多数量性状位点(QTL)控制，DNA分子标记辅助选择加速了传统育种过程。

1.1  基因组资源

    利用表达序列标签(EST)测序发掘基因产生了大量的基因组资源。Sawbridge等报道了从多年生黑麦草29个cDNA文库中随机挑选克隆，利用单通测序法获得了黑麦草不同组织器官，在不同生长时期及环境下的44534个ESTs序列。随后，Sawbridge等利用相同的方法获得了白三叶草不同组织器官，在不同生长时期及环境下的42017个ESTs序列。通过与GenBank、SwisstProt公共序列数据库进行比对可以对每个序列进行基因功能注释(gene ontology)。所有序列和注释可在MySQL数据库中以ASTRA格式保存，而基于BLAST在线网页序列比对和功能注释结果可获得分类树状图。基于这种方法可对每条黑麦草序列在EnsEMBL基因组数据库和水稻全基因组序列及其它相关物种的表达序列进行相似性比对；同样，可对白三叶草每条序列与拟南芥基因组序列及相关豆科植物表达序列进行比对分析。Ikeda等在生物和非生物胁迫下处理意大利黑麦草(Loliun；multiflorum)不同组织和叶片构建了7个cDNA文库，最后挑选单克隆获得了5922条ESTs序列。Tobias等从柳枝稷cDNA文库中获得了11990条序列，经序列拼接分析后得到了7810条特异基因簇。Cervigni等获得了半干旱地区画眉草(Enagrostts curvula)的7029条特异功能基因序列。Sato等对已获得的共26 356条红三叶草ESTs序列进行比对后发现，78%的序列与注册已知功能基因相似，这些相似序列主要集中在拟南芥和水稻中。

    利用细菌人工染色体(BAC)文库对于丰富EST数据是一种很好的策略。目前，构建了两个多年生黑麦草BAC文库，这两个文库共有控制黑麦草两个基因型的BAC克隆199680个，据估计两个文库平均插入片段大小约为100kh。Spangenberg等建立了多年生黑麦草和白三叶草的BAC文库，研究表明，多年生黑麦草50304个BAC克隆平均插入片段大小是113kh，相当于3.4个染色体组和97%的基因组覆盖率；而50302个白三叶草的BAC克隆平均插入片段大小为101 kh，相当于6.3个染色体组和99%的基因组覆盖率。

1.2  DNA分子标记

    遗传变异的研究分析有助于加深对植物分子基础的理解，在大多数植物不可能进行全基因组测序的情况下，分子标记及其与表型性状的相关分析在阐明遗传变异的分子机理上成为一个里程碑。根据其试验检测方法可将分子标记分为两类：一是以分子杂交为基础的RFLP；另一类是以PCR为基础的RAPD、AFLP、SNPs、SCAR、CAPS、RAMP、SRAP、TRAP、SSCP、IRAP、REMAP、S-SAP、RBIP、TD、MITES和IMP等。现仅就牧草中常用的标记进行阐述。

    限制片段长度多态性标记(RFLP)具有较高的可重复性和共显性等特点，已被应用于高羊茅和黑麦草等的遗传多样性和连锁图谱构建的研究中，由于其昂贵的试验花费和较高的试验条件要求，加之许多牧草序列信息未知而限制了其发展和应用。随机扩增多态性标记(RAPD)在目标物种序列未知的情况下可以进行分析，并可在短时间获得大量的标记，因而在许多未知DNA序列信息的牧草中得到了应用，如红三叶草、草地羊茅(Festuca elatior)和大针茅(Stipa grandis P. Smirn)。但该标记不能从纯合的个体中鉴定杂种个体，且在不同群体间转移性和重现性较差，因而其应用受到制约。与RAPD比较，扩增片段长度多态性标记(AFLP)有较高的重现性和更好的可转移性，在牧草作物遗传多样性、QTL定位连锁分析中得到了广泛的应用。简单序列重复标记(SSR)其具有多态性好、重现性高及共显性等优点。因此，在牧草作物中应用广泛，主要有禾本科中的多年生黑麦草、意大利黑麦草、高羊茅(Festuca arundinaacea)、梯牧草(Phleum pratense L.)、结缕草(Zoysia japonica)、鸭茅(Dactylis glomerata L.)和柳枝稷；豆科牧草中的白三叶草、红三叶草和苜蓿中也有报道。单核苷酸多态性标记(SNP)是一种较新的标记，目前仅在多年生黑麦草和白三叶草中有报道。Dracatos等在多年生黑麦草中用标记一性状关联分析法发现了抗病SNP和水溶性碳水化合物成分。多样性多序列芯片技术(DArT)是2001年发展起来的一种基于微阵列杂交技术的分子标记，在未知目标物种DNA序列的条件可同时检测数千个标记，目前仅见黑麦草和羊茅种(Lolium/Festuca)中有应用DArT标记的研究。相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新型的基于PCR的随机引物标记系统，在草种质资源研究中应用较少。

1.3  遗传多样性分析和应用

    物种遗传多样性研究既是人工选择进行群体改良的基础，又是对各种环境条件下最优群体进行分子鉴定的方法。利用分子标记可以直接对物种在基因组水平进行遗传多样性评价，实际应用中要根据研究目的和目标物种特异序列标记的可用性选择合适的标记类型。由于牧草遗传信息的缺乏，最初在牧草和草坪草中应用较多的标记主要是RAPD、IS-SR和AFLP，部分牧草ESTS序列信息获得后共显性标记SSR也在牧草遗传多样性分析中得到了应用。Zhang等同时利用SSR、SRAP、SSR和AFLP标记对采自五大洲的鸭茅种质资源进行了遗传变异和系统发育关系进行分析，结果表明，非洲北部、欧洲和亚洲温带可能是鸭茅的遗传多样性中心(2010年牧草、草坪草和能源草种质资源国际会议论文集)。SRAP因其可以在未知物种DNA序列时使用，近几年在牧草遗传多样性研究中得到了的应用。Budak等利用SRAP对野牛草[Buchloe doctylodes(Nutt.)Englem]进行了遗传多样性研究，Song等采用SRAP分子标记技术，对采自中国5个不同生态分布区的62份丹参(Salvia miltiorrhiza)材料进行了遗传多样性分析。功能标记直接和特定性状关联，到目前为止，在牧草和草坪草种质中仅有少数关联的基因标记报道。

    根据前人大量的研究成果，遗传多样性研究对牧草育种的主要作用可以归纳3个主要方面：一是指导种质资源收集，这在三叶草属(Trifolium)/黑麦草和羊茅草中已有报道。遗传多样性研究不仅对明确物种遗传多样性的地理分布提供了分子数据，同时对长期管理条件下遗传资源进化和生态过程的机制有了更多的理解。如Heremann等对红三叶草的遗传多样性分析结果表明，红三叶草Mattenklee(一种瑞士红三叶草)源于从Flanders和Brabant引入的种质资源，而并非源于本地野生红三叶草种群。Peter等采用SSR标记分析了草地羊茅，结果表明，生境和管理对草地羊茅生态型群体的遗传多样性有明显的影响，由此提出了从不同生境取样保护草地羊茅遗传多样性的策略。二是亲本选择。在禾本科牧草远系杂交育种中主要依靠用多系杂交方法选择的几个亲本互交。采用标记辅助亲本选择可以最大限度的利用杂种优势而减少近亲交配，使最优双亲进行组合。Kolliler等研究表明，选择遗传多样性丰富的多年生黑麦草双亲杂交后，其第一、二子代农艺性状表现更加优良，但是对分子标记遗传多样性和杂种优势的直接相关性未有明确报道。三是植物遗传资源的原位保护与核心种质库构建。遗传资源的原位保护对保持多样性基因库有重要的作用，而基因库中种质的利用常因其数量庞大和结构的复杂性受到较多限制，应用分子标记对基因库种质进行遗传多样性分析，在此基础上进一步构建核心种质库对提高种质利用率和降低保护成本具有重要的实践意义(2010年牧草、草坪草和能源草种质资源国际会议论文集)。

1.4  目标性状的基因定位

1.4.1  遗传连锁图谱的构建  利用遗传连锁图谱可以有效地将特定性状QTL定位于与其关联的标记位点，遗传连锁图谱的构建主要是在基因型分离定位群体和亲本及其杂交后代重组频率计算的基础上构建的。在牧草研究中最易获得的定位群体是临时群体F₂代，而永久群体重组自交系和回交系常不易获得，主要原因是许多牧草作物种质具有高度的自交不亲和性。当前用于牧草遗传连锁图谱构建的主要分子标记可以分为两类：一是用于第一代图谱构建的同工酶、RFLP和RAPD；另一类是用于第二代图谱构建的AFLP、SSR和SNP。

    利用两个杂合的个体杂交后产生的双拟测交群体(two-way pseudo testcross populations)常被用于自交不亲和的意大利黑麦草和红三叶草中。Brummer等和Hayward等采用RFLP标记分别以二倍体苜蓿(Medicago sativa L.)、多年生黑麦草和意大利黑麦草杂交的F₁代中间群体构建了牧草作物中的第一张连锁图谱，其中Hayward等构建的黑麦草连锁图包括了17个同工酶标记、48个RAPDs标记和41个RFLPs标记，这些标记被定位到7个连锁群，图谱全长692cM。随后，采用SSR标记构建了多年生黑麦草、意大利黑麦草、高羊茅、红三叶草、白三叶草和苜蓿的遗传连锁图谱。Forster等通过国际黑麦草基因组计划(ILGI)基于RFLP分子标记采用P150/112双拟测交群体构建了多年生黑麦草的遗传图谱，该图谱由来自小麦(Triticum aestivum Linn.)、大麦(Hordeum vulgare)、水稻和燕麦(Avena sativa)的不同探针共计109个RFLP位点组成。Jones等比较研究了多年生黑麦草与小麦，水稻和燕麦基因组图谱的直线性比较分析后，得出多年生黑麦草与禾本科植物种基本上有保守的同线性关系。目前，高密度的遗传连锁图谱在意大利黑麦草、草地羊茅、高羊茅、结缕草、鸭茅、梯牧草，以及多年生黑麦草和意大利黑麦草中间杂交群体中已经成功构建。Isobe等采用双倍体红三叶草F₁双拟测交群体构建了包括157个来自RFLP标记的cDNA图谱，Sato等通过整合来自DNA基因组和EST-SSR标记构建了包括1434个SSR位点，全长869cM的红三叶草图谱；随后，Herrmnn等在分析了红三叶草与紫花苜蓿和百脉根宏同线性(Macrosynteny)的基础上，利用第2个双倍体红三叶草双拟测交群体构建了包含216个AFLP和42个SSR位点，全长444cM的连锁图谱。据不完全统计，到目前先后采用EST-SSR和AFLP标记构建了双二倍体白三叶草的三张高密度连锁图谱，其中Zhang等采用来自三叶草族种(包括白三叶草、红三叶草、紫花苜蓿和大豆(Glycine max))的SSR标记和F₁群体构建了全长1877cM，覆盖全基因组87%的图谱。Sledge等基于EST-SSR标记构建了四倍体苜蓿遗传图谱，并用于干旱基因定位研究。为挖掘目标性状优异QTL和候选基因，在许多农作物种质中已构建了不同定位群体的一致性连锁图谱，Isobe等发表了红三叶草的第1张一致性连锁图谱，共有6个群体的1804个标记位点。

l.4.2  基因定位  在牧草作物中许多性状基因/QTL的定位分析为基因分离和分子标记辅助选择奠定了基础，这些性状主要包括：牧草品质，春化作用，多年生黑麦草抽穗期，意大利黑麦草抗倒伏及苜蓿中产量、抗寒性和生长因子。由于草坪草的经济价值较高，抗病性QTL研究一直是其重点，已鉴定了许多抗病QTL位点，包括冠锈病、青枯病和叶斑病。对多年生黑麦萆生理机制的研究中也有QTL定位报道，主要是对生长发育和干旱胁迫下果聚糖的研究。

    对多年生黑麦草、意大利黑麦草中相关性状基因/OTLs研究的报道很多。基于RFLP分子标记采用P150/112双拟测交群体构建的多年生黑麦草遗传图谱已被用于相关性状基因定位研究，这些性状主要包括控制生长生殖形态建成的性状、抗寒性、牧草品质和配予体自交不亲和性。Humphreys等报道了多年生黑麦草中水溶性碳水化合物(WSC)、中性洗涤纤维(NDF)、植株大小、叶伸长率和再生率QTLs的定位结果，这些QTLs分布于7条染色体上，解释的表型变异范围在23%-40%之间。Inoue等利用意大利黑麦草对控制抗倒性、株高、秆重、秆直径和秆强度、抽穗期及分蘖数共7个性状进行了定位研究，结果共检出除秆重外所有性状的17个QTLs，分布于6个连锁群。Forster等报道了采用多年生黑麦草杂交F₁群体进行芽和根部形态建成、光合作用、假茎水溶性碳水化合物及冠锈病基因定位的研究。利用多年生黑麦草其他定位群体对控制冠锈病、春化作用和花期调控基凶发掘的研究也有报道。利用多年生黑麦草和意大利黑麦草中间杂交群体进行QTLs发掘的相关研究也较多,主要是控制花期调控、纤维质、粗蛋白、抗寒性、抗灰霉病和冠锈病性状的基因。Studer等利用高抗青枯病的两个意大利黑麦草双拟测交群体F₁代，基于SSR和AFLP标记构建的图谱定位了一个主效应抗病QTL，该QTL解释67%的表型变异。随后，Studer等在意大利黑麦草第一、二连锁群上定位了两个抗冠锈病的主效应QTLs，共解释56%的表型变异。Ergon等对草地羊茅中种子产量相关性状，春化作用，抽穗期和穗数QTL也有报道。

    三叶草和苜蓿中基因/QTLs的定位研究也较多。Barrett等利用白三叶草定位了控制种子产量相关性状(如花序密度、每序产量和千粒重)的QTLs，随后Cogan等用构建的F₂代白三叶草群体发现了控制生长生殖形态的相关QTL。Herrmann等先后利用基于42个SSR和216个AFLP标记构建的F₁代白三叶草群体鉴定了控制种子产量8个相关性状的38个QTLs，这些QTLs分布于2个基因组上，簇状主效基因已被用于标记辅助选择。

    Robins等利用紫花苜蓿黄花亚种(Medicago sativa subsp. falcata)和紫花苜蓿紫花亚种(M. sativa subsp. sativa)构建的遗传连锁图谱在连续三季数据的基础上定位四倍体苜蓿产量、株高和再生性QTLs。Musisl等以同源四倍体苜蓿(Medicagosativa L.)为材料定位了调控根腐烂的抗性基因和控制产量及其相关性状的QTLs。Musial等和Mackie等利用同一同源四倍体苜蓿的回交群体共145个单株，分别定位了对草木犀壳多孢(Stagonospora meliloti)抗性、易感性和对三叶草刺盘孢(Colletotrtchum trifolii)3个种的作用QTL。

    植物个体性状表现复杂，一个性状可能受多个基因/QTLs控制，相应的一个基因/QTL也可能作用于多个性状。Isobe等提出了一种研究遗传变异中QTL互作的新方法：基因型模型定位(Genotype matrix mapping，GMM)，其结果表明该方法对于QTL-QTL互作及QTL-环境互作检测较有效。

1.5  标记辅助选择育种和关联分析

    与目标性状基因/QTL紧密连锁的分子标记已被应用于优异基因型选择和新基因渗入系培育为主的标记辅助选择育种中，标记辅助选择育种对常规育种中表型鉴定工作最大和无法直观检测的性状选择较有利，如产量相关性状和水溶性碳水合物。标记辅助选择需要有与目标性状紧密连锁的分子标记为前提，因而限制了其在牧草育种中的应用。当前，仅有少数相关报道。Barrent等在白三叶草中采用一个与种子产量QTL紧密连锁的SSR标记进行了标记辅助选择育种研究。关联分析(association analysis)，又称连锁不平衡作图(LD mapping)，是发掘基因和对基因功能研究的一种方法，可对目标群体中分子变异和表型变异间的关系进行分析，以实现特定目标性状基因鉴定的目的，关联分析根据其研究目的可分为两类，全基因组关联分析(genomewide association maping，GWAS)和候选基因关联分析(candidate-gene association mapping)。  Auzanneau等利用STS和SSR标记数据与3个多年生黑麦草人工合成品种中抗病基因数据进行关联分析发现，可将赤霉酸不敏感基因定位于一个很小的基因组区域。一种体外扩增SNPs鉴定的有效方法和SNP单模标本结构的研究已在多年生黑麦草中成功报道，该研究主要是基于PCR扩增和多重扩增序列对转录单位全部组成成分的扫描而实现对SNP检测的，在不同时间段通过转录单位检测了杂合双亲间多种SNPs，并在F₁代进行了验证。Skot等报道了利用候选基因法对多年生黑麦草中与花期和水溶性碳水化合物含量(WSC)等相关联的SNPs的变异情况，从群体内变异分析结果中鉴定了与WSC、氮和干物质消化率有关的一个候选基因碱性转移酶(LpcAI)，以及与水稻光周期控制基因HDl同源的控制多年生黑麦草花期的基因LpHDl。Cogan等利用从白三叶草栽培品种构建的多个cDNA文库中获得的EST序列进行了硅片(in silico)SNP检测和验证分析，通过对双亲和多个双拟测交定位群体的基因型分析，从选择的236个拼接序列中获得了58个经验证含有多态性的SNPs。

1.6  比较基因组学

    比较基因组学是对来源于不同物种的基因和基因组进行比较分析的方法，可以提高人们对物种如何进化及基因功能的理解。同源基因常位于相似的基因组区域，且在不同的植物种中其功能也相似，因此模式植物的研究成果为比较基因组发展提供了机遇。模式植物拟南芥的全基因组测序工作已于2000年完成。Zhu等通过对豆科模式植物蒺藜苜蓿和拟南芥的基因组比较分析发现，这两个物种基因组之间缺乏广泛的宏同线性，从而证明了拟南芥不能作为豆科基因组研究的模式植物。苜蓿近缘种蒺藜苜蓿和豆科杂草百脉根已被作为豆科牧草中的模式植物。水稻是单子叶植物研究中的模式植物，水稻大量的基因组资源为牧草和草坪草的研究提供了信息，但与主要谷粒作物相比依然有众多的因素限制了其利用。目前，二穗短柄草已被作为新的禾本科牧草模式植物。Wang等研究建议将与羊茅黑麦草关系较近的另一禾本科牧草毒草(Lolium temulentum)作为牧草和草坪草遗传工程研究中的模式植物。与其他牧草和草坪草相比，毒草优点较多：自花授粉、二倍体、无需春化处理、生命周期短和温室种植较易成活。Ge等已成功的建立了毒草的遗传转化体系。同线性分析对建立不同物种基因组区域问的直系同源性(orthology)较有用。直系同源的标记在亲缘关系较远物种间的可转移性可用于目前基因组和EST信息特别少的物种的遗传图谱的快速构建，利用比较遗传图谱和同线性信息可以鉴定与目标性状基因和候选基因紧密连锁的标记，快速分离到该基因。Zhu等利用大量的蒺藜苣蓿EST序列信息获得了许多杂交种遗传标记，并通过系统发育分析检测了直系同源位点，结果表明其同线性的程度与豆科种的系统进化距离间有一定的相关性，蒺藜苜蓿和紫花苜蓿之间具有高度的保守核苷酸序列同线性。基于蒺藜苜蓿和其他豆科植物之间的保守基因组结构可对目标性状基因进行图位克隆，Zhu等采用图位克隆方法同时在蒺藜苜蓿、紫花苜蓿和豌豆(Lathyrus odoratus L.)中克隆了3个直系同源性基因，该基因是调控细菌和真菌的结瘤受体激酶基因。Armstead等对水稻和多年生黑麦草之间的同线性区域进行了比较定位分析，利用水稻一个抽穗期QTL(Hd3)获得了多年生黑麦草中控制抽穗期的主效QTL。该QTL解释70%的表型变异，该结果表明利用水稻基因组对理解其他物种的生物进化过程具有可行性。Tmura等通过水稻基因组信息推测了禾本科牧草的内含子区域，据此从黑麦草属/羊茅属(Lolium/Festuca)ESTs序列设计了209个引物，其中61个引物是InDel标记，82个引物是CAPS标记并被用于区分多年生黑麦草和草地羊茅的研究中。许多InDel标记和CAPS标记对多年生黑麦草和草甸羊茅(F.pratensis)具有高度的特异性，利用这些标记对黑麦草属/羊茅属代换系植株的染色体定位结果表明，黑麦草属/羊茅属和水稻之间具有很高的同线性关系。

2  转基因在牧草育种中的应用进展

    通过常规植物育种方法进行牧草作物遗传改良周期较长，风媒异花授粉禾本科和虫媒异花授粉豆科牧草一般不耐自交，自交不亲和性又限制了利用同系繁殖进行优异基凶聚合培育新品种的可能性。常规牧草作物育种主要是以不同生态类型品种间或品种内的自然遗传变异和有性重组为基础的，利用转基因技术培育转基因植株可以获得独特的遗传变异类型。牧草转基因技术的研究应用主要集中在组织培养、二倍体诱导、再生、特定遗传变异的转化及植物生物合成途径的分子检测等方面。

2.1  组织培养和二倍体诱导

    单倍体植株来源有两种方式：一种是通过花药或者花粉粒培养的雄性单性生殖，另一种是利用远缘杂交后单倍体胚挽救的雌性生殖。自然或者化学诱导单倍体植株染色体加倍可以获得纯合的二倍体植株。雄性单性生殖主要是以从杂合二倍体植株获得单倍体，然后通过染色体加倍成纯合基因型。然而，在利用禾本科牧草中遗传型和表型变异较高的二倍体黑麦草属与羊茅属杂交群体中得到了优异的雄性单性生殖结果，这些群体在非生物胁迫抗性方面较之亲本基因型表现较高。通过这种杂交方式对培育渗入系和复杂性状的遗传及生理学解析较为有用。Andersen等对黑麦草、意大利黑麦草、梯牧草和鸭茅中单、双倍体诱导的受体植株要求，花药的采集及培养，培养基和再生条件等进行了详尽的报道。利用二倍体苜蓿花粉与四倍体植株杂交得到苜蓿双单倍体，获得了豆科牧草中孤雌生殖的成功，双单倍体已经用于揭示四倍体苜蓿中等位基因数目效用的研究。目前，在豆科牧草中通过花药培养单倍体的研究仅见紫花苜蓿，百脉根和埃及三叶草中有相关报道。胚挽救获得杂交植株在三叶草属中已有成功报道。

2.2  再生和转化

    关于禾本科和豆科牧草再生和转化的研究已有较多报道。由于体外试管再生和转化能力主要受基因型的影响，而具有高再生性和易转化基因型的组织常常不适于直接培养从而限制了其应用和发展。Li等利用花序组织建立了狗牙根的愈伤组织再生体系，并进行了gusA和bar基因转化，获得了转基因植株。Sun等首次报道了以羊草(Leymus chinesis(Trir.))成熟种子和叶基为材料通过体细胞胚胎发生建立的羊草高效再生体系。Ding等和Weeks等对苜蓿和其他豆科牧草中独立基因型遗传转化(genotype-independent transformation)进行了研究。出于无性生殖种子的形成可以容易地将优异基因转入生物品种以获得某些性状的改良，独立基因型遗传转化在单性生殖禾本科牧草中有着特殊的作用。选择标记基因(selectable marker genes)对牧草植株的有效转化鉴别是必不可少的，细菌抗生素和抗除草剂基因已被用于相关研究。通过携带叶绿素生物合成酶基因(hemL)突变体的抗植物毒素Gabaculine在鉴别转化苜蓿中取得成功，该过程没有使用抗生素和抗除草剂标记基因。Weeks等报道了未使用选择标记基因进行苜蓿转化的相关研究，但转化后标记消除在牧草中尚未有成功报道。转基因表达的稳定性(transgene expresion stability)是获得转基因植株后评价的一个关键指标,随着周期性选择表达水平在杂交子代可能会趋于减少，白三叶草中已有报道。Alexander等利用实时定量PCR内参基因(Reference genes)策略对苜蓿中转基因污染水平、拷贝数目和接合性进行了评价。

    目前，应用于牧草基因转化的方法较多，以基因枪法和农杆菌介导法为主。基因枪法是一种将外源DNA包被在金粉或钨粉微粒表面，在高压作用下轰击受体细胞或组织而达到稳定转化的方法。由于基因枪法是一个易操作的简单的生物物理过程，因而在转基因牧草中得到了广泛的应用，这些研究均以胚细胞为受体进行微粒轰击得到，主要有禾本科中的高羊茅、多年生黑麦草、意大利黑麦草(Lolium mulitiflorum Lam.)、鸭茅、草地早熟禾(Poa pratensis L.)以及一些暖季禾本科牧草如柳枝稷、百喜草(Paspalum notatum Flugge)以及盖氏虎尾草(Chloris gayana Kunth)。与基因枪法相比，农杆菌介导法有利于转基因低拷贝数目整合到植物基因组。近年，用农杆菌为载体的牧草转化体系研究取得了许多重要进展，这些牧草主要有禾本科中的高羊茅、多年生黑麦草、意大利黑麦草、羊茅黑麦草、鸭茅、暖季牧草柳枝稷和结缕草。豆科较禾本科牧草转化相对比较容易，Kalla等就主要豆科牧草农杆菌介导的遗传转化体系建立进行了报道。目前，通过农杆菌介导转化法已得到了转基因蒺藜苜蓿和白三叶草植株。

2.3  转基因植株选择性标记基因

    进行基因转化后，通过在适当的筛选转化选择压力下建立一个有效的选择方案对获得转基因植株是至关重要的。许多禾本科牧草对抗生素具有很高的内生抗性，特别是卡那霉素。目前，应用于禾本科牧草转化中的选择标记基因有：来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因hpb，来源于吸水链霉菌的草甘膦乙酰转移酶基因bar以及从细菌转座子Tn5中分离到的新霉素磷酸转移酶基因npt2。应用于禾本科牧草转化中的报告基因有：来自大肠杆菌染色体上uidA位点的β-葡萄糖苷酸酶基因gusA和得自维多利亚水母的绿色荧光蛋白基因mgfp。选择剂hpt和PPT也成功的被应用于禾本科牧草转化研究中。在农杆菌介导转化中，报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因gusA需有一个内部编码序列的内含子(如一个过氧化酶内含子)以确保来源于真核细胞葡萄糖苷酸酶活性的表达，而不是来源于通过残余农杆菌细胞的表达。用于构建嵌合基因(chimeric genes)的启动子有：花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子，水稻肌动蛋白启动子，玉米ubiquitin启动子和组织特异性启动子。终止子有花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子和胭脂碱合成酶基因nos终止子。

2.4  基因漂移及生物安全

    由于人类间接地消费牧草作物，转基因牧草作物的生物安全评价将可能集中在对环境和生态的影响方面。转基因牧草作物的生物安全，有两个问题需要研究：一是牧草花粉漂移的距离和保持自我发育的时间达到什么程度；另一个就是在自然条件下通过和相关物种杂交后转基因逃逸发生的概率是多少。可以利用分子标记技术研究这两个问题。禾本科牧草是靠风媒授粉和异型杂交的物种，豆科牧草是虫媒授粉种，在没有严格的授粉管理条件下，转基因植株花粉传播给其他物种或同种野生群体是不可避免的。wang等报道了花粉介导的来自转基因高羊茅植株的T₁和T₂子代基因漂流的试验，结果表明在相距200m的任何方向没有转基因漂移现象出现，由此提出了在小范围田间试验中，将转基因植株和其他物种隔离300m是完全可以防止基因漂移发生的。

2.5  转基因研究示例——木质素和果聚糖生物合成及其调控

    牧草的可消化性是影响动物生产力的一个限制因子，而引起牧草组织消化性降低的一个主要因素是植株细胞壁的术质化。通过负调控单木质素生物合成酶转基因的分子育种在改良牧草可消化性中进行了研究。利用肉桂酸脱氢酶和咖啡酸-O-甲基转移酶转基因负调控改良高羊茅的消化性已获得成功。木质素对利用植株结构多聚糖生产乙醇也有负面影响，在有纤维质的生物能作物中(如柳枝稷)减少木质素含量可以降低糖化作用的顽拗现象。Wang等采用RNA干扰基因结构实现了柳枝稷中木质素的负调控。果聚糖作为一种果糖聚合物，是在温季牧草中累计的非结构性碳水化合物的一种主要成分。可溶性碳水化合物水平的增加对提高牧草的营养价值作用明显。Ye等报道了通过转果聚糖蔗糖转移酶基因(Bacillius subtilis sac B gene)转化进行意大利黑麦草可溶性碳水化合物成分调控的相关研究。白三叶草在正常情况下没有果聚糖累积，Jenkins等进行了白三叶草果聚糖转基因研究，结果表明在转基因白三叶草中果聚糖的积累主要是在CaMV35S启动子的操纵下，通过来源于唾液链球菌(Streptococcus salivarius)的果糖基转移酶(Ftf)的表达产生的。Gadegaard等获得了蔗糖(蔗糖1-果糖基转移酶)和果聚糖(果聚糖6G-果糖基转移酶)表达量提高3倍的多年生黑麦草植株。果聚糖与抗寒性也有关系。Hisano等采用基因枪转化法在CaMV 35S启动子的操纵下，获得了过量表达小麦果糖基转移酶基因wft1(wftl编码蔗糖-果聚糖6-果糖基转移酶，6-SFT)和wft2(wft2编码蔗糖-蔗糖1-果糖基转移酶，l-SST)的转基因多年生黑麦草植株，与未转基因植株相比，转基因植株累积了大量的果聚糖使其细胞抗寒性也增加了。这些结果表明，wft1和wft2基因的过量表达参与了果聚糖合成，据此提出了培育抗寒牧草的新策略。

3  展望

    现代生物技术的应用加速了传统牧草遗传育种改良的步伐，随着现代科学仪器和各种新技术的不断创新和发展，生物技术在牧草遗传育种中的应用前景诱人。基因表达谱为发掘与目标性状关联的候选基因提供了新的途径，其中cDNA-AFLP分析在意大利黑麦草感染青枯病差异表达的转录和多年生黑麦草自交不亲和应答关键元件的鉴定中应用成功。目前在水稻、小麦和玉米中利用微点阵分离了许多差异表达的目的基因并发表了许多可供利用的公共数据，迄今，在牧草和草坪草中尚未发表可利用的微点阵平台信息，但已有采用微点阵分析进行模式植物蒺藜苜蓿(M. truncatula)的研究报道。图位克隆(map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，该方法无预先知道基因的DNA序列及其表达产物的有关信息，它是根据目的基因在染色体上的位置进行分离，是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。目前在牧草中采用图位克隆基因的研究鲜有报道，然而已经产生了用于图位克隆的大量基础数据，如意大利黑麦草和多年生黑麦草中BAC文库的构建，RFLP和SSR标记在7个连锁群的定位，约50 000条ESTS序列的发表。利用已构建的各牧草种连锁图谱和定位数据结合序列信息进一步图位克隆相关基因进行转基因研究亟需加强。基于双脱氧测序法对水稻和拟南芥等模式植物全基因测序研究已经完成，但由于基因组测序的高成本而限制了其在基因组较大植物(如大麦、小麦和黑麦草)中的应用。下一代基因组测序(next-generation genome sequencing)技术具有高准确性、高通量、高灵敏度和低成本等优点，可以同时完成传统基因组学(测序和注释)，功能基因组学(转录组分析、基因表达及调控、基因功能、蛋白-核酸相互作用)以及表观基因组学研究，可在几天产生Gb级的序列。随着下一代基因组测序技术的快速发展，许多牧草(如蒺藜苜蓿、百脉根)的基因组序列有望在不久发表(http：//www.genomesonline。org/)。

    以基因组学和转基因为核心的分子育种为现代牧草育种作出了重大贡献，但应用于牧草新品种培育中的成果较有限。随着测序技术的发展将产生越来越多ESTs，基因分离也将更加容易，利用生物信息学对目的基因在转录组和代谢水平上的功能进行研究为牧草遗传育种提供了新的理论和思路。

    作者单位：(1.西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100；2.西北农林科技大学资源与环境学院，杨凌 712100：3.中国科学院水利部水土保持研究，杨凌 712100)

        文章采集：caisy

        注明：国家重点基础研究发展计划“973”项目（2007CB106803）