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植物耐寒机理与耐寒植物新品种培育
日期:2012-04-18 作者:王达 马纪 来源:《生物技术通报》.-2012,(1).-7-11 点击:
 

    在自然环境中,温度是影响植物生长、发育的关键因素,低温会导致植物受到严重损伤或使植株死亡。低温灾害是农业、园林生产中一种严重且普遍存在的自然灾害。据统计,1996年新疆北疆地区因夏季持续低温造成全疆棉花单产减产达7%左右;2001年北疆大部分棉区7月底出现的障碍型低温冷害致使北疆沿天山一带大部分棉区棉花单产减产幅度达30%-50%。低温灾害导致农林植物受伤害而造成巨大的经济损失,因此,研究植物抗寒性的生理机制并积极培育抗冻耐寒植物新品种,具有重要的理论意义和解决实际生产问题的应用价值。

1  低温对植物造成的伤害

    研究表明,冷害引起的植物损伤首先发生在细胞膜系统。冷冻造成的脱水现象导致膜系统损伤。低温引起植物胞外或胞内结冰,由于胞外空间冰点较高且有一些杂质作为冰核,所以胞外先干胞内形成冰晶。冰晶溶液比液态溶液的水势低得多,并且温度越低水势差值越大,因而胞内的水分通过质膜流出,导致细胞严重脱水。脱水会对细胞造成严重伤害,包括膜结构的改变和功能的丧失。脱水后升温,原生质迅速膨胀而裂解;脂分子双层被破坏,部分膜脂疏水头部聚在一起形成直径2nm的六角锥形结构(lamellar-hexagonal-phaser transitions.HexII);在经低温驯化的原生质体中,可以观察到膜片跳跃(fracture-jump lesion Fjl)现象,可能是由于质膜与其他细胞膜,尤其叶绿体被膜融合而引起。HexII损伤只发生在没有驯化的细胞中,而Fil则在低温驯化细胞中广泛存在,而且在许多植物中都能发现。此外,由于低温诱导而产生的过氧化物也能损伤膜结构,胞外形成的冰晶刺伤细胞壁或细胞膜引起细胞的破裂。这些均使质膜失去渗透反应能力。低温还会使温度敏感的蛋白质变性,冷敏感水稻细胞液泡膜ATP酶等酶活性降低,而质膜ATP酶活性变化小。

    总体来看,低温会造成细胞内冰晶形成和生长、渗透势的改变及低温直接导致的细胞活性降低,进而使植物细胞膜结构受损、部分蛋白失活,影响到细胞正常的生理功能,甚至造成细胞的破裂死亡,影响了植物的生长发育或导致植物死亡。

2  植物耐寒的分子机理

    植物对低温的应激是一个复杂的过程,包括低温信号的感受、信号转导和转录调控等阶段。低温时,质膜流动性降低,细胞可以通过质膜上的钙离子通透性通道、组氨酸激酶、受体激酶和磷酸酯酶等各种感受器而感知低温,并通过不同的信号传导途径最终激活相关基因表达。图1是我们汇总的植物对低温响应的示意图。这里主要讨论在植物体内起到抗冻作用的主要基网和产物。目前所发现的植物体内具有抗冻作用的物质主要有抗冻蛋白、脯氨酸、SOD等,这些物质起到抑制冰晶生成、维持渗透压平衡及抗氧化等相关作用,最终达到维持细胞膜系统稳定性和酶活性的目的,从而增强了植物在低温下的耐受性。

2.1  抗冻蛋白基因

    抗冻蛋白(antifreeze proteilIsAFPs)是一类能够抑制冰晶生长的蛋白质,可非依数性(non-colligatively)地降低水溶液的冰点,但对熔点的影响很小,使水溶液的熔点和冰点间产生差值即热滞值(thermal hysteresis TH),从而起到抗冻的作用。目前已从鱼类、植物、昆虫及细菌中克隆得到多种抗冻蛋白基因,其中昆虫体内的抗冻蛋白具有最强的阻止冰晶生长的能力。Gmham从黄粉虫中分离出的一种抗冻蛋白THP8.4,其降低冰点的活性比鱼抗冻蛋白高10-100倍。

    植物自身的抗冻蛋白可通过冷驯化获得。1970年,WeSEr首次提出了植物抗寒性诱导过程可改变基因表达的观点。随后,人们研究了冷驯化过程中产生的特异性蛋白或基因,并对这些蛋白与植物耐寒性之间的关系进行了研究。胡萝卜 AFP基因在非冷驯化状态下不表达,冷驯化状态下表达水平迅速而特异性地提高。Huang等从冬季欧白英(Solanum dulcamara L.)中克隆得到一种热滞蛋白基因sthp-64,将其以融合基因的形式克隆于大肠杆菌表达载体,得到了全长的热滞蛋白STHP-64STHP-64蛋白抗冻活性很低,但柠檬酸盐作为活性增强剂能提高其抗冻活性。Zhang等从腊梅(Chimonanthus praecox L.)的花瓣中分离得到一种33kD的质外体几丁质酶CpCHT1及其cDNA,该基因在叶、树皮和根等组织中都是组成型表达的。这种几丁质酶可以修饰冰晶形态形成并具有较高的热滞活性,说明其具有抗冻蛋白特性,而且这种几丁质酶还可以抑制4种致病真菌孢子的萌发,从而使植物具有抗病能力,说明该酶是一种多功能的蛋白质。Sidehonom等在过冬的多年生黑麦草(Lolium perenne)中分离出一种热稳定性极高的抗冻蛋白,能耐受100高温,其重结晶抑制活性约为大洋条鳕AFP Ⅲ的200倍,这种能力使黑麦草可以承受组织间的结冰而不至于受到伤害,这表明相比于阻止结冰,控制冰晶的生长才是黑麦草存活于低温的关键因素。但该抗冻蛋白的热滞值(0.10-0.45)远远低于鱼类(1.0-1.5)和昆虫(5-6)

    植物抗冻蛋白的基本特性表明,它具有热滞活性,可以抑制冰晶生长,具有较高的重结晶抑制能力,因此,它对植物的保护作用是直接的;其他冷诱导蛋白只是间接调节酶或通过信号传导等一系列温度适应机制来调节植物的抗寒性。

2.2  抗渗透胁迫相关基因

    在低温和干旱等环境胁迫时,植物通过诱导渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达,增加这类物质的积累,从而调节离子的平衡状态,维持渗透压的平衡。植物的渗透调节物质主要包括脯氨酸、甜菜碱等。大量试验证明,通过转化脯氨酸合成酶基因可增强转基因植物的耐寒性。Nnajo将脯氨酸脱氢酶(脯氨酸降解关键酶)反义基因AtproDHcDNA转入到拟南芥中,有效地抑制了此酶的产量,提高了胞内脯氨酸水平,增强了植物抗渗透胁迫能力。对玉米研究表明,低温能诱导玉米胚芽中编码两种脯氨酸富集蛋白基因HyRP(杂种脯氨酸富集蛋白)HRGP(羟脯氨酸富集蛋白)的表达,这两种蛋白都具有明显提高玉米抗寒的能力。

    甜菜碱是另一类常见的渗透调节物质。植物受到低温和干旱胁迫时,甜菜碱醛脱氯酶(BADH)活性增强,BADH基因的表达量增加,从而使甜菜碱大量积累。某些植物种类在低温胁迫下积累甜菜碱以适应低温,提高对冰冻的忍受力。把编码甜菜碱生物合成酶的基因转到某些原来非积累甜菜碱植物上,也能积累甜菜碱并提高抗寒性。

2.3  抗氧化酶基因

在正常情况下细胞具有抗氧化能力,由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和还氧化氢酶(CAT)组成的防御系统可以清除体内一定量的活性氧,但是在低温下由于酶活性下降以及活性氧簇(reactive oxygen speciesROS)产量剧增,这种防御能力很有限。研究表明,细胞抗氧化能力与植物的抗逆性呈正相关。Gupta等将外源Cu/Zn SOD基因导入烟草中,转化株的叶绿体中SOD超表达,活性升高,同时抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidaseAPX)活性升高,增加了烟草抵抗低温造成光抑制的能力。Allen等研究发现,将SOD基因转入烟草增强了烟草的抗氧化能力,将其转入棉花使其抗冻性增强。Kornyeyev等发现,棉花叶片过量表达叶绿体中定位的抗氧化酶基因SODAPX可以提高光能的利用,减轻冷诱导条件下对光系统Ⅱ的抑制。

2.4  抗膜脂相改变的基因

    冻害引起的质膜伤害包括:膨胀引起的破裂、片层相位的相变和断裂伤害。许多植物在低温驯化过程中发生了膜脂成分的变化,这种变化与膜在低温下的稳定性相关。近年来对膜脂改变的分子机理有了较深刻认识,研究发现,甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-ph-osphate acyhransferaseGPAT)和去饱和酶desA蛋白(desatured A)是与膜脂流动性有关的蛋白。Kodama等将从拟南芥中克隆的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)导入烟草中,转基因烟草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提高,在低温下表现出明显的抗寒性,证明了三烯脂肪酸水平的提高对植物耐寒性有较重要的作用。

    Matsuda等发现,拟南芥体内两种ω-3脂肪酸去饱和酶FAD7FAD8尽管有高度的结构同源性,但对温度的应答机制完全不同。拟南芥中表达反义氨基磷脂移位酶基因则会使其冷敏感性增加,说明这种跨膜的双层脂非对称与植物的冷驯化相关。将拟南芥的甘油-3-磷酸酰基转移酶转入水稻,提高了水稻中磷酸甘油非饱和脂肪酸的含量,提高了水稻在低温下的光合速率和生长速率。将去饱和酶基因转入烟草体内后,转基因植株体内大多数膜脂的C16C18饱和脂肪酸含量水平降低,植株的耐寒性显著增强。

2.5  冷诱导基因

    植物冷诱导基因(cold induced genes)是一种诱发基因,只有在特定条件(主要是低温和短日照)下才得以启动和表达,进而使细胞表现出抗寒能力。COR基因(cold-regulated gene,又称LTI基因)是拟南芥中研究最多的冷诱导基因,还被称为KIN基因、RD基因,包括COR6.6CORl5aCOR78COR47等。拟南芥叶绿体的COR15a能有效地防止乳酸脱氢酶的冷冻失活,其效果比蔗糖高106倍,比其他蛋白高102-103倍。Artus等将COR15a基因转入未经冷驯化的拟南芥属植物,获得抗寒性增强的转基因植物。Kave等将CAP85CAP160基因转入烟草,证实其减缓了冰冻造成的细胞损伤过程。研究发现,拟南芥的COR15a基因受低温、干旱或ABA处理时能诱导表达产生15kD的多肽,此多肽与叶绿体结合后转变为94kD的多肽CORl5am。将组成型表达的cORl5am基因导入拟南芥,发现转基因植株的叶绿体和原生质体的抗冻性提高1-2,增强了原生质体膜的稳定性,但是没有发现对整个植株水平的抗冻性有明显作用,其原因可能是低温驯化诱导多个COR基因共同表达并协同发挥抗冻作用,如果仅提高其中一种COR基因的表达不足以使植物表现出复杂的抗冻性状。

3  抗冻蛋白在培育植物耐寒新品种中的应用

    植物的冷耐受能力是由微效多基因控制的数量性状,虽然全面提高植物的抗寒能力需要多种基因的协同作用,但是由于抗冻蛋白阻止冰晶生长的特性,所以植物在抵抗零下气温的冻害时,抗冻蛋白的作用更加重要和不可或缺。Antikainen等发现,经2-5低温驯化后,AFPs只在抗冻的单子叶植物叶片质外体中积累,而在不耐寒的玉米中则无AFPs积累。在所研究的双子叶植物中无论抗寒性较强的菠菜、油菜和羽衣甘蓝,还是不耐寒的烟草等,均未检测到AFPs的存在。研究表明,只有部分生长于低温环境中的植物或一些经过冷驯化后的植物可以产生抗冻蛋白,而且由于植物抗冻蛋白的热滞活性不高,所产生的抗冻蛋白量较少,不足以形成较强的抗冻能力。因此,利用基因工程方法将外源抗冻蛋白基因转化植物是提高植物抗冻能力的有效方式。

3.1  植物抗冻蛋白基因的利用

    研究表明,提高植物抗冻能力的一个基本措施就是避免冰晶在体内的形成及阻止冰晶的生长。而植物AFPs有别于其他低温诱导基因表达所产生的蛋白,它具有类似于一些昆虫或鱼类AFPs的阻止冰晶形成、调控胞外冰晶的增长及抑制冰的重结晶等特殊作用,被认为是植物细胞内重要的抗冻剂,其抗冻基因的导入或许更有利于转基因植物抗冻性的提高。因此,近年来人们还尝试将克隆到具有热滞活性的植物抗冻蛋白基因导入植物来改良植物抗冻性。Worrall等将胡萝卜AFPs基因导入烟草,所获得的转基因烟草叶提取物能抑制冰晶生长,其中有两株叶提取物的热滞活性分别为0.350.56,这是首次利用植物AFPs基因进行植物抗冻改良的成功报告。随后,该抗冻基因再次被成功地转入到烟草,转基因植株的抗冻性明显高于对照。

3.2  动物抗冻蛋白基因的利用

    Davies等首次将美洲拟鲽抗冻基因整合在Ti质粒上,用叶圆片法转化郁金香、烟草和油菜等植物,转基因植株都获得了一定的抗冻性,这是植物抗冻性基因工程的开端。Georges将人工合成的冬鲽鱼的afp基因和编码氯霉素酰基转移酶的Cat基因构成嵌合基因后导入玉米原生质体并获得表达。Hightower等将冬季比目鱼中的spa-afa5afa3基因导入烟草和番茄中,发现转基因所表达的蛋白具有抑制冰晶形成的作用。Wallis等将人工合成的冬鲽鱼afp基因以及afp与植物凝集素Pha基因组成的嵌合基因分别导入马铃薯,均能减少转基因马铃薯细胞在低温下电解质的渗漏。黄永芳等采用花粉管道法及子房注射法,将美洲拟鲽afp基因导入番茄,转基因番茄在低温下的生长优于对照,而且致死温度也比对照降低2

    由于昆虫抗冻蛋白热滞活性明显高于鱼类,其抗冻基因的导入有望更有效地提高转基因植物的抗冻性,据此人们尝试开展昆虫抗冻蛋白基因导入植物的研究。Holmberg等首次将云杉卷叶蛾抗冻蛋白基因(sbwAFP)CaMV35S及胭脂碱合成酶基因组成嵌合基因后导入烟草,基因的氨基酸编码序列按照烟草大量表达的核基因优化,发现转基因烟草中质外体shwAFP的表达能抑制冰重结晶,并提高了热滞活性。Huang等将赤翅甲科昆虫(Denndroides canadensis)AFPs基因(dafps)通过农杆菌介导法转化拟南芥,在有或无信号肽条件下,AFPs基因在转基因植株中都得到表达,但与野生型株系相比,转基因株系的耐冻性并未明显提高。Wang等将荒漠昆虫小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafpl49通过农杆菌介导转化烟草,在-1处理3d的情况下,转基因烟草的电导率和丙二醛含量变化显著低于野生型烟草,表明转化小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149赋予了烟草抗冻能力。

    目前,来源于动物的抗冻蛋白普遍比植物抗冻蛋白具有更高的热滞活性,迄今为止人们发现的具有超高热滞活性的抗冻蛋白来源于昆虫,昆虫抗冻蛋白的热滞活性往往是植物抗冻蛋白热滞活性的几十至几百倍。这可能是由于昆虫恶劣的生存环境及昆虫特殊的生理特点导致的。所以在转基因抗冻植物研究中使用动物抗冻蛋白基因,特别是昆虫抗冻蛋白基因将会使植物产生更好抗冻能力。但是由于种间差异性的存在,动物抗冻蛋白基因在植物体内可能由于编码差异或蛋白表达后加工方式的不同,导致在植物体内不能将动物抗冻蛋白基因准确地表达,无法产生有效的抗冻蛋白,从而无法赋予植物抗冻能力。相对地,由于不同植物的种间差异性较小,所以使用植物抗冻蛋白基因转化植物发生这种情况的可能性较小。因此,在应用动物抗冻蛋向基因转化植物时,最好对该抗冻蛋白的表达与加工特性有一定的了解,并根据植物的编码特性对该抗冻蛋白基因进行密码子优化,以期获得更好的抗冻效果。

4  讨论

    通过研究植物抗冻机理,人们发现了多个可以提高植物抗冻能力的基因或相关产物,也有很多基因转化植物并赋予了植物抗冻能力。但这些植物大部分是烟草、拟南芬等模式植物,虽然证明了相关基因的功能,但并没有实际应用于生产实践。人们对一些植物的抗冻品种培育研究并不多,例如,棉花的转基因育种目标主要集中于抗虫、抗病及抗除草剂等方面,开展抗冻棉花培育的很少,而实际上低温灾害对棉花的生产造成的危害并不亚于虫害、病害。因此,开展某些受低温灾害影响巨大的经济作物的抗冻品种培育工作,具有重要意义。

    现在通过外源基因转化提高植物抗冻能力的报道中,多数只转化一种或几种具有相同功能的基因,这样难以充分提高植物的抗冻能力。所以利用现有的具有不同抗冻机理的多基因联合转化植物,以期在冰晶抑制、抗渗透胁迫、抗氧化及保持膜脂相的稳定等各方面系统地提高植物的抗冻能力,将会使抗冻植物研究达到新的高度。

    虽然植物抗冻品种培育研究起步较晚,但目前对植物抗冻机理研究较深入,而且已得到了抗冻蛋白等很多抗冻相关基因或产物,其中相当一部分基因已经转化模式植物并验证了其抗冻能力,在此广泛、明确的研究基础之上,植物的抗冻品种培育必将得到迅速进展。

    作者单位:(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源与基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046)

    文章采集:caisy

    注明:转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08005-022B

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