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叶绿体转化体系研究进展
日期:2012-04-18 作者:王金辉 李轶女 倪丕冲 王国增 张志芳 沈桂芳 来源:《生物技术通报》.-2012,(1).-1-4 点击:
 

    叶绿体是植物重要的光合器官,广泛存在于植物的细胞和真核藻类中,为有机体生存、繁殖和发展提供最初的能源,同时释放氧气,合成淀粉、脂类、氨基酸和色素等。叶绿体是具有核外遗传物质,并且具有转录和翻译机制的细胞器之一,基因组大约在120-180kb之间,环形双链的DNA,包括大的单拷贝区、小的单拷贝区和两个方向重复区。叶绿体也是理想的外源基因表达的受体,外源基因同源重组到叶绿体的基因组中,可以在叶绿体中高效表达。近年来,叶绿体转化表现出巨大的应用前景,用于改良作物的形状,作为生物反应器生产疫苗、药物和工业产品等,也被应用到基础研究中,研究叶绿体基因组的转录、mRNA编辑、光合作用和进化等。

1  叶绿体转化的物种

1.1  衣藻

    衣藻是真核单细胞生物,其结构简单,遗传背景清楚,易于培养,利于遗传操作和工业生产,被称为“绿色酵母”。1988年,Boynton等首次利用基因枪法将带有atpB野生型基因的叶绿体DNA轰击了atpB突变的衣藻,使其恢复了光合作用的能力,从而标志着叶绿体基因工程的开始。Goldschmidt等。于1991年成功实现将aadA基因作为筛选标记来获得转入目的基因的莱茵衣藻转化子,很大程度上提高了叶绿转化的效率。

    随着衣藻叶绿体转化技术的日益成熟,衣藻叶绿体作为一种生物反应器,具有很多其他生物反应器所不具备的优点。首先,表达量高。试验证明藻青蛋白(apcAapcB)在莱茵衣藻叶绿体的表达量占可溶性蛋白总量的2%-3%,从而表明叶绿体表达体系高表达量的优越性;其次,叶绿体具有原核性,但也能表达真核蛋白质,并且对表达后蛋白质进行加工,表达产物以活性形式积累。Mayfield等根据莱茵衣藻密码子偏爱性合成了编码IgA抗疱疹抗体的基因(hsv8Isc),在莱茵农藻叶绿体中表达了折叠正确的可溶的有活性的蛋白。DreeSem等将葡萄球菌的D2纤维连接蛋白结构域与霍乱毒素的B亚基融合(CTB-D2)在衣藻叶绿体中表达,口服表达抗原疫苗的小鼠中,80%的小鼠可以抵御金黄色葡萄球菌的感染,表达的产物比较稳定,可以在室温保存至少一年半。

    赵雅坤等在衣藻叶绿体中成功实现了人白细胞介素4(hIL4)的高效表达。1999年,张中林等利用基因枪法将丙肝病毒融合抗原基因NS3-C在衣藻叶绿体中表达。试验结果证明,用衣藻叶绿体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的。杨宗岐等在衣藻叶绿体中表达来源于Pyrococus furiosus的耐高温α-淀粉酶,酶活检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,鲜重衣藻最高达77.5U/g。该结果表明,完全可用莱茵衣藻作为生物反应器实现超耐热酸性α-淀粉酶的工业化生产。Kmse等利用基因工程手段使转基因莱茵衣藻产生氧气,从而使通过基因工程的手段生产清洁能源成为可能。

1.2  茄科植物

    1990年,有研究者首次利用基因枪法将rrn16基因在烟草叶绿体中得到表达,拉开了高等植物叶绿体转化的帷幕。Golds等用PEG法也将rrn16基因转化到烟草叶绿体中,探索出了一个稳定叶绿体转化的方法。1993年,Carrer等报道了利用卡那霉素基因作为烟草叶绿体转化的筛选标记,转基因植株的新霉素磷酸转移酶(NPT )占细胞总蛋白的1%。叶绿体转录的mRNA以多顺反子为主,将无启动子的uidA基因插入叶绿体rbcL基因的下游,由于rbcL基因的终止子的效率不高,转录出了包含uidA基因的多顺反子。uidA基因在叶绿体中得到了较高的表达,表达产物GUS在转基因植株中得到了较高水平的积累,证明在叶绿体中离启动子较远的顺反子也可以有效地翻译。

    由于植物受哺乳类病毒污染的风险小,成本低,可以大面积种植,所以用植物作为生物反应器生产人类的医用蛋白成为一个研究的热点。Staub等将人类的生长素基因转入烟草的叶绿体基因组中,表达出了可溶性,具有生物活性,二硫键正确的蛋白,高浓度的可溶性蛋白占叶绿体可溶性的7%以上,是核转化表达量的300倍。结果证明叶绿体是一种高效的人类医药蛋白的生物反应器。

    为了研究在植物抗逆过程中活性氧(ROS)清除系统具有调控抗氧化酶活性的功能,Le Martret等。将脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)3个基因重组到烟草的叶绿体基因组中,过量表达这3种酶,氧胁迫、高盐、冷,以及重金属胁迫转化植株,发现在叶绿体中增强部分的抗氧化途径可以提高植物非生物胁迫的耐受能力。

    烟草叶片的再生能力强,可以直接在叶片上进行叶绿体和同质化等,所以烟草的叶绿体转化比较成熟,取得了较大的进展。人们也相继成功地进行了了茄科植物马铃薯、番茄和茄子的叶绿体转化。Sidorov等利用烟草的叶绿体转化载体成功的转化了马铃薯,将aadAgfp基因重组到马铃薯叶绿体基因组中。2001年,Ruf等在番茄(Lycopersicon esculentum)的叶绿体转化中取得了成功,将aadA基因转化到叶绿体基因组中,外源基因表达量占可溶性蛋白的40%以上,为利用番茄表达口服疫苗、抗体及药物等奠定了基础。2010年,Singh等利用烟草叶绿体的叶绿体转化载体trnV-rps7/12成功的将筛选标记基因aadA重组到茄子的叶绿体中,为改良茄子的性状提供了一种新的转化方法。叶绿体基因组比较保守,茄科植物的叶绿体转化大部分都是利用烟草叶绿体的同源片段进行重组的。

l.3  禾本科植物

    水稻、玉米及小麦等禾本科植物是重要的粮食作物,但是叶绿体转化技术在禾本科植物的应用进展较缓慢,受限制的主要原因可能是通过幼胚诱导的愈伤组织,前质体与叶绿体基因组的表达调控不相同,外源基因同源重组的效率低;禾本科植物的叶片再生能力弱,叶绿体转化同质化比较困难。2006年,Lee等首次将gfpaadA基因成功重组到水稻(Oryza sattiva)叶绿体基因组中,为叶绿体转化技术在禾本科植物中的应用奠定了基础。李轶女等选择ndhFtrnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点,将bar基因重组到水稻叶绿体基因中,bar基因在水稻基因组中正常的表达,既提高了水稻抗PPT的能力,又可以作为转化的筛选标记。Cui等利用基因枪法将gfpnpfⅡ基因转化小麦未成熟盾片和花序,培养获得了转化植株,为叶绿体转化技术成功的应用到禾本科植物培育新的品种奠定了基础。由于禾本科植物对壮观霉素具有天然的抗性,所以一般不用aadA作为筛选标记基因,而Lee等利用链霉素对转化的水稻愈伤进行筛选。

1.4  油料作物

    大豆作为一种重要的油料作物,培育优良的大豆新品种一直是人们研究的热点。自1996年孟山都公司开发的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次销售,到目前为止已经有超过1000个商业化的抗草甘膦大豆品种。由于核转化的生物安全性令人担忧,转基因大豆会通过“基因漂移”而破坏非转基因大豆的原始基因,从而造成生态危害,而叶绿体转化的生物安全性高,可能会很好地解决基因漂移的现象。Dufourmantel等利用基因枪法成功的转化了大豆,将aadA基因重组到大豆叶绿体基因组中。

    McBride等将融合的抗虫的crylAc基因转化到烟草叶绿体中,表达量占可溶性蛋白的3%-50%Hou等将aadA基因和抗虫的crylAc基因一起转化到油菜的叶绿体基因中,获得的转化植株有比较良好的抗虫性。2003年,Skarjinskaia等在油料作物Lesduerella fendlleri中也成功进行了叶绿体转化,将aadAgfp基因重组到叶绿体基因组中。

1.5  其他

    Sikdar等利用基因枪法转化拟南芥(Arabidopss thaliana)叶绿体基因组,获得抗壮观霉索的转化植株。Chiyoda等建立了简单有效的地钱叶绿体转化体系,成功对培养的地钱悬浮细胞进行转化,将aadA基因表达盒重组到地钱叶绿体trnI/trnA位点,aadA基因表达盒中的启动子是烟草叶绿体Prrn,终止子是烟草叶绿体TPsbA

    2008年,De Marchis等利用aadA基因作为筛选标记,gfp基因作为叶绿体转化的检测标记,将aadAgfp基因的表达盒成功地重组到甜菜叶绿体基因组rrn16/rpsl2位点,检测发现gfp基因在甜菜叶绿体中有较高水平的表达。

    已经成功进行叶绿体转化的物种有胡萝卜、棉花、矮牵牛、西兰花、莴苣、杨树和甘蓝等。

2  讨论

    与核转化相比,叶绿体转化的最大特点是表达量高、安全性高。显花植物每个叶肉细胞含有约10000个叶绿体基因组拷贝,如果完全同质化并有强启动子存在,外源基因可以得到高效的表达,同时叶绿体对外源基因的表达有很强的承受能力。人血清白蛋白在烟草叶绿体中表达量占可溶性总蛋白的11.1%,比核转化的表达量高500倍。但是,由于叶绿体的拷贝数高,同质化是叶绿体转化亟待解决的问题之一。必须不断的增加筛选压,提高同质化程度。叶绿体是母系遗传,外源基因不会随花粉传播,造成基因漂移。Ruf等研究发现,有极低水平的父本基因泄露,其中基因进入到F1后代子叶中的频率是1.58×10-5,而进入到顶端分生组织的频率是2.86×10-6。叶绿体转化定点插入,遗传稳定性好,不会出现性状分离的现象;可以直接表达来自原核的基因;叶绿体基因组具有原核性叶绿体基因组多顺反子转录、基因排列、调控方式及密码子的偏爱性等与原核性很相似;叶绿体的原核性利于原核来源基因的表达,真核基因在叶绿体基因中也能很好的表达。

    叶绿体转化成为继核转化之后又一个高效的技术,在衣藻、烟草等20种植物中都取得了成功,其中至少有40种外源基因在烟草叶绿体中进行了成功表达。由于衣藻易于培养,生长周期短,转化效率高等,所以外源基因成功转化衣藻叶绿体的报道最多,一般利用衣藻作为生物反应器表达外源基因。在高等植物中,茄科植物成功进行叶绿体转化的物种比较多,模式植物烟草的再生能力强,转化效率高,所以比较容易进行叶绿体转化。由于叶绿体基因组比较保守,同一科内叶绿体基因组的差异很小,番茄(S.lycopersicum)和马铃薯(S. bulbocastanum)叶绿体基因组的差异为0.6%,颠茄(A.belladonna)与茄属和烟草属内物种叶绿体基因组差异不超过2%,所以马铃薯、番茄等利用烟草的同源片段、启动子和终止子也成功进行了叶绿体转化。番茄、甘蓝等蔬菜成功进行叶绿体转化为利用叶绿体转化改良蔬菜的营养品质奠定了基础。由于水稻、玉米等禾本科植物的外植体的再生能力比较差,必须经通过幼胚诱导的愈伤组织才能再分化,再分化的能力受到愈伤质量的限制,叶绿体转化后同质化比较困难,所以叶绿体转化在禾本科植物中进展的比较缓慢。由于禾本科植物愈伤诱导技术已经比较成熟,为叶绿体转化奠定了基础,在重要粮食作物水稻、小麦中取得成功为叶绿体在农业生产中的应用奠定了基础,可以利用叶绿体转化培育抗虫、抗除草剂、抗病等作物新品种。

    随着分子生物学的发展,尤其是测序技术的进步,对叶绿体基因组的研究逐渐深入,到目前为止,已经公布了235组真核生物叶绿体基因组,这其中包括同一种的不同亚种。大量植物叶绿体基因组测序,可以根据植物的叶绿体基因组设计特异的叶绿体同源载体,提高同源重组效率,同时为叶绿体在更多物种中的应用奠定了基础。叶绿体转化作为一项安全高效的体系,越来越受到重视,成功进行叶绿体转化的物种也在不断增加,势必为利用植物表达外源基因提供一个理想的平台。

    作者单位:(中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)

    文章采集:caisy

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