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植物HAP3转录因子研究进展
日期:2012-04-05 作者:刘亚静 张盾 张凌云 来源:《生物技术通报》.-2011,(11).-6-10 点击:
 

    转录因子(transcription factorsTFs)是指能够和真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白或能够与这些蛋白发生相互作用的相关蛋白质,即指能够特异性的激活或抑制转录的关键因子。转录因子是信号转导途径中的关键因子,因为信号转导途径首先要激活一些转录因子,再由它们启动信号反应基因的转录,继而这些靶基因的产物产生对信号的生理学和生物化学反应。自从1987Paz-Ares首次报道玉米转录因子基因的克隆以来,人们已相继从高等植物中分离出调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子数百种。例如,拟南芥中仅含有27000个基因,就有5.9%的基因编码转录因子,而在植物特异蛋白中,转录因子占到13%。根据DNA结构域的不同,植物中转录因子主要分为MYBhZIPWRKYDREBNACAP2等。其中,HAP转录因子是近年来新发现的具有多种生物功能的植物特异性转录因子。

    CCAAT框是哺乳动物、植物及酵母基因中较常见的一种促进因子。Hap复合体,在动物体内也称为NF-YCBF,可以与CCAAT框结合并控制基因的表达。该复合体在哺乳动物和植物中包括3个不同的亚基:HAP2/NF-YA/CBF-BHAP3/NF-YB/CBF-AHAP5/NF-YC/CBF-C,在与DNA结合的过程中,它们都发挥着重要的作用。每个亚基都包含一个在进化过程中的保守区域,负责与DNA结合以及与蛋白质互作,另外还包括若干非保守区。与哺乳动物和植物不同,在酵母中,HAP复合体包括4个亚基:HAP2HAP3HAP4HAP5。其中,HAP4只参与HAP复合体的组成,不参与和基因CCAAT框的结合。Lotan最早提出在植物中可能存在CCAAT转录因子,其功能和酵母以及哺乳动物中的HAPNF-Y类似。但后来的研究发现,植物中确实存在HAP转录因子,但是与酵母和哺乳动物中的每一个HAP亚基只由一个基因编码不同,植物所有亚基都是甫HAP基因家族编码。例如,拟南芥基因组编码了10At NF-YA13At NF-YB13At NF-YC亚基。目前,对HAP3基因家族的部分成员的研究已经比较深入,可是对拟南芥、水稻和玉米HAP2HAP5基因家族成员的研究还不甚成熟。

1  HAP3转录因子的结构特点和分类

    HAP是进化中较保守的转录因子,在哺乳动物和植物中包含3个不同亚基HAP2(CBF-B)HAP3(CBF-A)HAP5(CBF-C)。在哺乳动物中,首先,HAP3HAP5结合形成二聚体并转移到细胞核内,接下来与HAP2结合形成HAP复合体,进而HAP复合体和靶基因的CCAAT框结合并控制基因的转录。在植物中,目前尚未发现HAP复合体调控特定基因的表达或者调控特定的生物过程。但是HAP2/3/5基因单独行使特定生物学功能已经得到证明。

    HAP3包括3个结构域:氨基端和羧基端分别有一个不保守的A(A domain)C(C do-main),中部有一个保守的B(B domain)。其中B区是HAP3基因中较重要的区域,因为HAP3通过B区氨基酸残基与其他亚基相互作用,HAP复合体也可通过HAP3B区与DNA结合。模式植物拟南芥的HAP3家族共有10个成员,LEClL1L属于LECl(LECl-type),另外8个属于非LECl(non-LECl-type),不具有LECl基因的功能。LECl型的B区有16个氨基酸与非LECl型的保守残基是不同的。另外,L1L的异位表达可以阻止LECl的突变,这表明两者在功能上等效。研究表明,B区是决定LECl功能的关键区域,该结构域特有的氨基酸残基Asp55是其调控胚胎发生的必要条件,同时能够使非LEClB结构域具备部分LECl型基因的活性。

    已有的研究表明,HAP3转录因子主要参加了胚胎发育、叶绿素生物合成及花期调控等生物过程的调节,下面主要对这些方面的研究进展做一简要的介绍。表1略列出了一些植物HAP3转录因子可能的功能。

2  HAP3转录因子在胚胎发育中的作用

    被子植物胚胎发育从早期的双受精到后期的种子成熟主要经历以下几个阶段:合子激活、细胞分裂与分化、极性建立、模式形成、器官发生和储藏物质积累等。植物的早期胚胎发育是伴随着细胞分裂而进行的,所涉及的重要生物学过程包括合子激活、极性建立、模式形成和器官发生等。而胚胎发育后期主要是储藏物质的累积,为种子能够耐受长时间的干燥储藏做准备。储藏物质包括蛋白质、糖类和脂质等大分子化合物,而LECl基因对营养物质积累方面的促进作用正是其在植物胚胎发育后期功能的体现。前人的研究表明,LEClLlL主要在胚胎发育后期也就是种子发育过程中发挥作用。

2.1  LECl在胚胎发育后期的作用

    LEAFY COTYLEDON(LEC)转录因子建立了胚成熟阶段促进细胞群发育的环境并且促进了体细胞胚的形成。最近的研究表明,LEC转录因子激活了潜在的特异目标基因,主要在胚发育的成熟阶段和体细胞胚的形成阶段起作用。Braybrook等认为LEC转录因子在控制脱落酸与赤霉素平衡方面的作用体现了其在植物胚发育的成熟阶段和体细胞胚形成阶段的作用。

    研究表明,LECl基因主要在胚胎发育过程中发挥作用,是调控种子成熟的关键因子。拟南芥LECl基因在种子发育中的胚细胞和胚乳组织中表达,在种子发育的早期和晚期都发挥重要作用。拟南芥lecl突变体植株在胚中出现了一些异常,幼胚在鱼雷期过后提早成熟进入萌发途径,并获得了只有植物营养组织才具有的特点,胚中也没有积累种子储藏性蛋白,暗示LECl基因在胚胎发生过程中起重要作用。Loton等研究发现,在lecl突变体或野生型拟南芥中过量表达LECl基因,会造成转基因后代幼苗的畸型,保持了胚胎的特征,如子叶不能张开、根不能伸长等。部分存活下来的幼苗可以无性生长,但在叶片发现胚状体,这表明LECl基因在营养细胞中的异位表达可诱导胚特异性基因表达。

    研究人员自首次从拟南芥中分离得到LECl基因后,便相继从胡萝卜、玉米和向日葵等植物中克隆出LECl基因,而且都与拟南芥LECl基因具有很高的同源性。Yazawa等分离了胡萝卜LECl基因(C-LECl),发现其在胚性细胞、体细胞胚中表达,但不在胚乳中表达。以拟南芥LECl基因启动子驱动的C-LECl在拟南芥中的表达能够与拟南芥lecl-1突变体的缺陷互补,这表明C-LECl基因是拟南芥LECl基因的功能性同源物,在胚的发育中与拟南芥LECl基因有类似的功能,是合子胚和体细胞胚发育的重要调控因子。Zhang等在研究玉米LECl基因(ZmLECl)时发现,ZmLECl在玉米体细胞胚中的表达模式与在拟南芥合子胚中的表达模式一样,表明在获得胚形成能力后,体细胞胚与合子胚有着相似的发育途径。LECl基因编码了控制种子成熟的关键的转录因子,其中包括种子中关键蛋白质(SSP)的积累,尽管LECl突变下调节SSP基因表达已经广为人知,但是其作用机理还不很清楚。Stone等认为LECl可能建立了一个细胞环境,这种环境可以促使与胚胎形态发生和在种子成熟的相关基因协同表达,从而促进了胚胎的发育。

    Kagaya等研究表明,拟南芥中的LECl通过调控ABl3FUS3控制种子中储存蛋白基因的表达,发挥调控种子储藏蛋白积累的功能;但是LECl的活性依赖于启动子中的ABA反应元件,只有当环境中存在ABA时,LEClNF-YC2共表达,激活一种编码种子储藏蛋白的基因的启动子——CRUCIFERIN(CRC)。另外,LECl也可以和一种ABA响应元件(ABA-response element/ABRE)结合因子bZIP67共表达,调控蔗糖合成酶2(sucrose synthase 2/SUS2)的表达。Casson利用一个AtLECl功能增益的突变体,发现其内部有外源性生长激素和糖类的大量积累,表明体细胞胚中LECl功能的发挥需要激素和蔗糖以最终促进细胞分裂和胚分化,揭示LECl基因和激素以及糖类之问可能存在某种联系。

    在拟南芥中过表达AtLECl后,脂肪酸的生物合成基因全面增加,这些基因都参与了脂肪酸生物合成的关键反应包括缩合、链的延长以及饱和脂肪酸的生物去饱和,表明AtLECl和脂肪酸的生物合成存在正向关系。研究发现,在过表达LECl的转基因植物中,超过58%的编码脂肪酸合成途径所需酶的基因的表达量增加了,包括编码脂肪酸合成的关键酶乙酰辅酶A3个亚基,而且参与糖酵解和脂类积累的基因的表达量也增加了,最终导致转基因植物中的脂肪酸和脂类水平大量增长。基因分析表明,在调控脂肪酸合成方面LECl功能的发挥与ABSCISIC ACID INSENSITIVE3FUSCA3WRI-NKLEDl有一定关系,表明LECl基因作为关键调控者调控着脂肪酸合成基因的表达,这也暗示了油脂作物目标基因工程的又一发展。

2.2  L1L在胚胎发育后期的作用

    LEAFY COTYLEDONl-LIKE(L1L)是拟南芥中一种与LECl较相似的基因,同样在胚发育中起刊了重要作用。与LECl类似,L1L主要在种子发育时期表达。但L1L的突变体的缺陷与LECl突变体的缺陷不同,说明LlLLECl在诱导胚发育基因表达中的作用不尽相同。L1L是一种新的胚发育的调节因子,是一个HAP3亚基中的新的成员。

    LECl一样,当环境中存在ABA时,L1LNF-YC2共表达,激活编码种子储藏蛋白的基因的启动子——CRUCIFERIN(CRC)L1L也可以与ABHE结合因子——bZIP67共表达,调控SUS2的表达。在过表达甘蓝型油菜两个L1L基因的转基因拟南芥中也观察到了脂肪酸合成基因表达量。Fambrini等研究发现向日葵的LlL基因和拟南芥LlL基因氨基酸序列比对的相似性高达56%。试验表明,HaLlL主要在向日葵胚形成初期表述,在发育的胚乳、胚柄、珠被以及珠被绒毡层中都检测到了高浓度的haL1L mRNA,表明其在胚发育过程中有较重要的作用。另外,在复生叶维管束附近的薄壁细胞中HaL1L mRNA的易位积累表明其可能参与体细胞胚胎发生的过程,其在胚胎发育以及体细胞胚胎发育方面的功能研究有待深入。Alemanno等研究发现可可树的L1L基因与拟南芥的L1L基因具有很高同源性,在拟南芥L1L突变体中表达LaLlL可以恢复一些胚胎发育中的表型,推测可可树L1L基因也在胚胎发育中发挥作用。SchellerLbaum等通过半定量反转录聚合酶链反应技术发现葡萄(Vitis vinifera L.)L1L基因也参与体细胞胚胎发生的过程。

3  HAP3转录因子在叶绿素生物合成及花期调控等过程中的作用

    Miyoshi从水稻中分离出3种基因,可能编码了结合水稻CCAAT框的HAP3复合体,并命名为OsHAP3AOsHAP3BOsBAP3C,这些基因在包括叶片等不同器官中表达。在转基因水稻中,他们通过构建反义和RNA干扰结构,观察了降低OsHAP3AOsHAP3BOsHAP3C的表达量后的表型,包括叶片颜色变浅,叶绿素含量下降,叶绿体发生退化,基粒发育不良,以及淀粉不能合成。叶绿素的退化与其细胞核内光合作用基因,例如RBCSCAB表达量的降低相偶联,而编码叶绿体基因的表达量却不受影响甚至增加。这表明一个或者多个OsHAP3基因控制了编码细胞核内叶绿体目标基因的表达,同时也控制了叶绿体的发育。用组成型启动子过表达NF-YB3基因的转基因小麦表现出了叶片中叶绿素含量、光能合成率、早期生长率的提高,表明小麦(Triticum aestivum)NF-YB3基因也参与了光合作用基因的调控。

    Wenkel等研究了拟南芥AtHAP3基因的生物功能。他们检验了AtHAP3b并获得两个At-HAP3b T-DNA插入的突变体,结果表明hap3b-1hap3b-2突变体在长日照条件下要比野生型开花晚。不仅如此,还发现AtHAP3b在渗透胁迫条件下表达量增加。hap3b突变体和野生型植株在渗透胁迫下花期显著不同,表明AfHAP3b主要参与了渗透胁迫下的花期调控。在拟南芥中过表达HAP3a推迟花期,而过表达HAP3b可以使花期提前,这显示出了HAP3aHAP3b两个基因在花期调控方面截然不同的功能。另外AtNF-YB2AtNF-YB3通过调控长日照条件下FT的表达,对花期调控也有重要作用,这一结果可能有助于揭示AtHAP3调控花期的路径和机制。有研究者通过图位克隆的方法分离了一种水稻的HAP3基因DTH8。相关试验数据表明,DTH8基因长日照条件下抑制水稻开花,推测它可能对在控制水稻潜在的植株高度和收获量方面有着重要作用。

    最近,Nelson等报道在干旱条件下过表达拟南芥AtNF-YBl转录因子,可以比野生型有更高的产量;同时,在玉米中过表达ZmNF-YB2也表现出了对干旱的抗性,这说明HAP3基因在植物的抗旱性方面也发挥着一定作用。Ballif等发现在拟南芥中过表达,AtHAP3b促进了主根的伸长,利用运动学分析也发现过表达AtHAP3b的拟南芥的主根细胞的伸长速率要比野生型的快。运用GUS染色也发现,AtHAP3b主要在根尖表达,而根尖恰恰是根中细胞分裂和伸长发生的部位,说明AtHAP3b在调控根的伸长中发挥作用,推测HAP3基因正是因为促进了根的伸长,提高了根从土壤中吸收水分的能力,从而使植物的抗旱能力得到提高,这一点有待进一步研究和验证。

4  展望

    近年来,对哺乳动物和酵母中的HAP复合体以及单独的HAP亚基研究已经较为深入。植物中HAP家族作为一个新兴的研究领域,只在模式植物拟南芥和重要农作物玉米、小麦等基因组相对比较简单的植物上做了一些简单的生物信息学比对、基因的表达定位以及初步的功能研究。这些起步研究为人们认识植物中HAP家族提供了大量的基础数据和方向,但是,人们对这些现象的分子生物学机制的认识还很有限、且不成体系,还有许多问题亟待解决。

4.1  HAP家族在植物抗旱性方面的研究

    过表达拟南芥AtNF-YBl基因,可以比野生型有更高的产量,而且过表达ZmNF-YB2也表现出了对干旱的抗性,在NF-YB的抗逆性方面也可以深入探讨,可以和其促进根的伸长相联系,将有可能通过提高植物的抗旱性达到提高干旱地区和干旱年份粮食作物和经济作物的产量。

4.2  HAP家族调控转录的分子机制

    LEClLlL基因调控转录的分子机制有待深入,需要进一步阐明其调控转录的作用机制。例如,LEClL1L基因作为关键因子调控着脂肪酸合成基因的表达,AtLECl影响脂肪酸合成的作用机制有待进一步明晰,这将有助于提高油脂经济作物的产量并相应地提高经济效益,特别是一些产量较低,未能大批量生产的木本油料作物。

4.3  HAP家族在粮食作物和木本植物的研究

    从表1略中可以发现,对植物中HAP3转录因子的研究始于模式植物拟南芥,进而在经济作物、粮食作物等非木本基因组较简单的被子植物上有了一些进展,因此对于其他重要粮食作物和木本植物HAP家族和单独基因的研究有待深入。

4.4  HAP家族基因表达和DNA甲基化的联系

    DNA甲基化在许多有机体各种各样的发育过程中都起着较重要的作用。在胡萝卜中,用DNA甲基化处理胚形成细胞导致了低的甲基化水平的出现,而且阻碍了体细胞胚的形成。Shibukawad等研究表明,当LECl 5端上游1272-1904区域的甲基化被RdDM诱导,C-LECl在转基因胡萝卜胚形成层细胞中的表达会被抑制,这表明DNA的甲基化与C-LECl的表达负相关。DNA的甲基化可能在胡萝卜的胚发育过程中控制C-LECl的表达。而甲基化与C-LECl表达负相关的分子机制有待进一步探讨。此外,各类HAP基因发挥功能的最佳条件有待进一步摸索,这将有助于更好的利用HAP基因。

4.5  HAP蛋白复合体的研究

HAP2HAP3HAP5基因共同编码了一个HAP蛋白复合体。每个HAP家族都有一个保守区域,同时在长度和氨基酸序列上都有许多不同的非保守区域。它们表现出了不同的基因表达模式,同时观察到HAP2HAP3HAP5以不同的组合重叠表达。例如,蛋白质互作分析表明水稻中HAP不同家族的相互作用,通过组织特异表达以及3种亚基的特异性结合,HAP复合体能够调控水稻生长发育的许多方面。目前,HAP家族基因包括HAP3基因的研究还主要停留在对单个基因的功能研究上,还未能从整体层面上研究HAP复合体,若能够阐明HAP各个基因家族之问的互作规律,将是该转录因子研究上的重大突破。相信随着研究的深入,HAP基因家族包括HAP3的价值会逐渐凸显出来。

    作者单位:(北京林业大学 森林培育与保护教育部重点实验室,北京 100083)

    文章采集:caisy

    注明:国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08009-062B

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