您当前的位置:首页 >> 科技中心 >> 科技进展 >> 生物技术 >> 国内 >> 正文
枯草杆菌耐药转运蛋白Bmr及其基因bmr的表达调控研究进展
日期:2012-05-23 作者:关维 陈仪本 来源:《微生物学通报》.-2012,(2).-249-253 点击:
 

    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)广泛应用于食品、饲料等,虽然不会对人畜造成重大安全威胁,但会通过污染食品、日化产品,腐蚀皮革、木材等对生产生活造成危害,并目枯草杆菌对喹诺酮类抗生素及其他杀菌剂可产生耐药性,对食品、化妆品的防腐,生产设备及医用器械等的消毒,提出了严峻挑战。Nevhkh等早在1991年就报导,枯草杆菌可通过主动外排作用,对罗丹明6G、溴化乙锭、氯霉素等产生耐药性,此后许多学者对于枯草杆菌耐药现象进行了研究,Martin等在内窥镜清洁器中发现对二氧化氯耐药的枯草芽孢杆菌,表现出对氧化性杀菌剂过氧乙酸和过氧化氢的交叉耐药,这些都引起广泛关注。研究中发现,枯草芽孢杆菌有多种耐药相关的转运蛋白,可将有毒害的物质运出膜外,其中最主要的是Bmr蛋白。目前的研究主要集中在Bmr的作用机制与bmr的转录调控机制。这些研究可以更深入地揭示Bmr耐药作用及转录调控机制,为其耐药性治理的研究提供理论依据,也能为其他多重耐药转运蛋白的研究提供一定参考。

1  枯草杆菌Bmr及其编码基因bmr

    Bmr蛋白是一种多药耐药转运蛋白(MDRtransporter),是最早发现的细菌多药外排蛋白之一。研究指出,多重耐药转运蛋白对有毒物质的外排作用是细菌产生多重耐药(MDR)的最主要机制,MDR转运蛋白一般由特定的染色体基因编码,根据氨基酸序列和结构,可分成6个超家族,MFS(Major facilitator superfamily)是其中最大的家族,包括1000多种膜转运蛋白,涉及糖类、氨基酸、无机阴离子、胺类等多种物质的跨膜转运。

    BmrMFS的一员,其耐药谱广泛,包括各种疏水性阳离子、氟喹诺酮类抗生素、吖啶染料、氯霉素等。该蛋白的编码基因bmr存在于枯草芽孢杆菌的染色体中,Neyfakh等通过两步法构建了含bmr基因和一个强启动子的质粒载体pBMR2,导入Bacillus subtilis BD224,由于重组质粒上bmr基因的大量表达,氯霉素、嘌呤霉素等抗菌药对其的MTC(最低抑菌浓度)值提高了7-31倍,从而证明bmr基因的过量表达介导这种耐药性,并且当bmr基因被敲除,细胞对Bmr底物的耐药性减弱,同时,导入外源bmr基因能使缺失MDR转运蛋白的细菌产生耐药表型。作者在研究枯草杆菌对季铵盐型杀菌剂的耐药性时发现,以苯扎氯铵(BAC)作为诱导剂,1/2 MIC法连续诱导数代,BAC对几株受试枯草芽孢杆菌的MIC值增加2-3倍,可能也与bmr基因的大量表达相关。

2  多耐药转运蛋白Bmr的结构和作用机制

    Bmr具有12个跨膜片段(TMS),作用方式为药物-H+逆向转运,12-TMS是由一个编码6次跨膜结构的基因重复表达而来,跨膜α螺旋区存在许多高度保守的氨基酸序列,由于膜蛋白的疏水特性,Bmr难于得到结晶以进行结构上的研究 ,研究与之高度同源的蛋白QacAQacB时发现,TMS-10有保守的带负电荷的氨基酸残基,对二价阳离子的转运起到至关重要的作用,Edgar等研究发现,MFS家族另一个成员MdfATMS-1中有一个嵌入细胞膜的保守的谷氨酸-天冬氨酸残基,对阳离子型底物的转运起到重要作用。作者据此推测Bmr也具有这种对耐药转运起关键作用的保守的氨基酸残基,可通过基因定点突变研究予以确认。

    Bmr蛋白的作用机制为不依赖ATP的药物-H+逆向转运。同前的学说认为,Bmr具有疏水的底物结合腔,底物从细胞质膜内侧进入腔内,位于Bmr跨膜区的酸性氨基酸残基的质子/去质子化作用驱动药物结合位点再定向,由朝内变为朝外的构象,从而使药物从膜内转运到膜外。比起其他家族的耐药转运蛋白,目前对MFS家族的了解最浅,且Bmr蛋白的晶体结构仍未知,故实际的作用机制并无定论,最终结论还有赖于对Bmr高分辨率结构的研究。

3  bmr基因的表达调控

    bmr基因的表达受BmrR的局部调控和MtaN的全局调控,作用方式均为结合启动子与药物配体,激活bmr基因的转录,其表达调控原理如图l所示。

    这两种调节因子均属于MerR家族。bmr操纵子的六聚启动子元件与典型的细菌肩动子元件不同,其-10-35元件之间的间隔为19 bp,比常见的非限制性启动子长2bp两元件位于DNA的不同侧,偏离正常相平面70°。额外的碱基对引起启动子元件空间错位,阻止形成有转录活性的RNA聚合酶启动复合物。MerR调节子可识别这种启动子,和启动子结合后,迫使DNA扭曲变形,使两种元件重新定位到DNA的同侧,从而使它们能够同时被RNA结合聚合酶结合,启动子与RNA聚合酶σ-70亚基有效作用,激活转录。调节子-启动子间作用具有特异性。MerR家族转录因子模型见图2略。

3.1  局部调控因子BmrR

    BmrR由一个紧邻并位于bmr基因的下游基因bmpR编码,它与MerR家族的其他成员在N末端和螺旋-转角-螺旋DNA结合域有高度同源性,是目前研究最多的MDR转运蛋白调节子之一。

3.1.1  BmrR的结构:Heldwein2001年在Nature上发表的论文,清晰地揭示了BmrR的结构,此后陆续有许多科学家进行了深入的研究,Kumaraswami等利用X射线衍射法研究了游离BmrR与结合DNABmrR的晶体结构,得出许多有价值的晶体学数据。研究表明,BmrR多肽链由3个部分组成:(1)一个N末端的翼状螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合基序,外加2个额外的螺旋;(2)一个11圈的α螺旋,它与其他亚基构成反平行卷曲螺旋并负责连接NC末端区域;(3)C末端α/β多药结合域。BmrR二聚体由一个α螺旋连接2个单体而形成,该α螺旋形成一个反向平行的卷曲螺旋,呈现出2个对称排列的翼状螺旋域,毗邻DNA大沟。BmrR结构见图3略。

3.1.2  BmrR的作用机制:bmr的转录激活机制已经研究的比较清楚,过程涉及局部碱基对断裂,碱基滑动,-35-10位操纵子元件重排。首先,BmrR以二聚体的形式结合到bmr操纵子-35-10元件的19bp间隔区的反向重复序列,药物结合BmrR后引起DNA结构高度扭曲变形:启动子在中部背向蛋白质,朝向DNA大沟弯曲50°,启动子假二联体序列周围的A-T碱基对断裂,未配对的腺嘌呤和胸腺嘧啶各自向3′的方向相互滑动。DNA这种扭曲的构象,使DNA有效解旋,启动子缩短-35-10元件重排,最终使35-10元件构象变得接近典型的17bp间隔的启动子,从而促进σ因子和RNA聚合酶结合,以及转录起始位点的DNA解链。磷酸骨架与Tyr24Tyr25Lys60残基和N末端的螺旋α4之间的相互作用能维持这种扭曲构想的稳定性。

3.1.3  BmrR识别和结合底物机制:研究发现,Bmr的底物(如罗丹明,TPP)BmrR结合,能增强BmrRbmr基因启动子的亲和力,从而诱导bmr的表达,增强耐药性。BmrR的药物底物结构多样,共性是带正电荷,有一定的疏水性。BmrK识别和结合底物是一个简单的“锁一匙”配合的过程,仅需在结合位点创造一个疏水环境,由于缺乏特异性决定簇,战结合位点对药物配体几呼没有选择性,只取决于结合位点的几何结构。

    BmrR底物识别和结合发生在C末端(BRC)Zheleznova等研究BRC-TPP复合物晶体结构显示。TPP结合位点是一个刚性口袋状结构,由7个疏水的氨基酸残基构成。TPP诱导BRC产生局部构象变化,αl螺旋绕其N 端旋转10°,C端展开,连接α1α2螺旋的紧密转角伸展开,Tyr33Cα原子移动11.5A,其侧链完全离开蛋白核心,α2螺旋解折叠,从结合位点离开,从而暴露出结合口袋。Glu21接近α2螺旋而且产生负电荷,吸引TPP及其他阳离子配体,使带正电荷的配体分子进入药物结合口袋。Newberry等研究发现,药物结合是通过与口袋里的一些疏水残基(Phe244Tyr268)相互作用介导的,并通过带正电荷的药物和埋减的谷氨酸残基之间静电相互作用而结合(Glu253),药物存在时,Glu253的羧基侧链与3个酪氨酸残基Tvr33Tyr68Tyr110(在全长BmrR中为Tyr152Tyr187Tyr229)的羟基形成氢键,负电荷被“中和”,形成一种芳香基团围绕一个带负电荷的侧链的结构,能吸引芳香族和疏水性阳离子的结合。最近Bachas等通过X射线法对BmrR与多种底物配体的结合作用进行结构上的研究,更深入地揭示了BmrR的底物识别机制。其结果支持了 BmrR底物结合口袋模型,并且发现,芳香族基团形成一个刚性环状平台以供不同底物结合,极性原子对底物结合也起到重要作用。

3.2  全局调控因子MtaN

    枯草芽孢杆菌bmr基因的全局调节因子是Mta,为转录激活子,能结合DNA和与小分子底物相互作用。Mta也属于MetR家族,由257个氨基酸残基组成,其NC末端在功能上可以分离,全长的Mta不能激活bmr基因的转录,起作用的是Mta蛋白N 端的109个残基(MtaN),包括Mta蛋白的DNA结合区及和二聚化区,分别将MtaMtaN的编码基因克隆入枯草杆菌质粒载体,导入mta敲除株,发现前者并不引起耐药性的改变,溴化乙锭对后者的MIC值增加3倍,表明这种多重耐药性是由于MtaN末端部分激活bmr基因的表达而引起的。

    与其他MerR家族成员一样,MtaN以二聚体形式其作用,其结构是一个翼状HTH基序,MtaN二聚体的每个亚基包括一个N-末端DNA结合域,紧随之有一个8圈的螺旋α5α5/α5螺旋构成反向平行卷曲螺旋,稳定MtaN二聚体的结构,DNA结合域属于翼状HTH家族,包括一个四螺旋束和一个三股的反向平行β片层。每个MtaN单体包括βl-αl-α-β2-α3-α3-β4-β5拓扑结构。其结构见图4略。

    MtaN的转录激活机制与BmrR类似。mta启动子-35-10元件间隔19 bp,MtaN二聚体结合启动子26bp的脱氧寡核苷酸片段,完整的35元件六聚体及-10元件六聚体的1bpMtaN结合DNA后,其每个DNA结合域旋转11°,并向内平移6 Å,导致两个DNA识别螺旋的中心距离(α2α2)33.2 Å缩短到29.5ÅMtaN通过HTH基序和翼状区WlW2结合mta启动子,DNA磷酸骨架在中部弯曲47°。感应到信号分子后,MtaN二聚体的DNA结合域发生构象变化,使DNA变形然后激活转录。

4  结语与展望

    对于Bmr功能及bmr基因转录调控机制已取得令人瞩目的成果,Bmr底物及其他药物配体结合转录调控蛋白,诱导bmr基因启动子DNA变形以激活转录的机制已基本清晰,转录调控蛋白 BmeR药物结合口袋模型揭示了其识别和结合配体的原理。但是有一些问题仍需更进一步的研究:(1)Bmr蛋白晶体结构还未见报道,亟待了解其结构特征以研究其耐药转运机制。而且Bmr可能具有耐药转运之外的其他未知的生理功能,目前在MFS中已发现有少数成员具有与多药耐药无关的生理功能。(2)MtaN调控机制还有待进一步验证。MtaN结合mta启动子的结构显示,有与MerR家族相似的DNA变形及构象变化,但是MtaN的底物配体还未知。(3)MtaN识别多种启动子的机制还未知。已知的MtaN的启动子结合靶位差异很大,只有12个共有的碱基对,利用DNase l足迹试验研究MtaN蛋白在DNA上的结合位点,仅发现其中6个,结合位点的碱基对保守性非常有限。MtaN如何识别多种启动子,还有待进一步深入研究。作者研究枯草杆菌对季铵盐型杀菌剂苯扎氯铵(BAC)的耐药性时,经诱导数代后的枯草杆菌对BAC产生一定耐药性,预期结果是bmrbmrR基因表达水平与枯草杆菌对BAC的耐药水平呈正相关关系,正进行实时荧光定量PCR研究这种相关性。

    随着这些问题的深入研究,定能更加清楚地揭示Bmr的转运机制、BmrRMtaN调控机制,对于其他相关耐药转运蛋白以及转录调控因子的研究提供方法和借鉴。通过这些研究,能发掘耐药相关蛋白抑制剂的作用靶位,有助于研制耐药蛋白抑制剂以进行细菌耐药性的治理,具有显著的现实意义和应用前景。

    作者单位:(1.中国科学院南海海洋研究所 广东 广州  510301)(2.广东省微生物研究所 广东 广州 510070)(3.中国科学院研究生院北京 100049)

    文章采集:caisy

    注明:广东省科技计划项目(No.2007B31800009,2008a010500005,2120B010800042

注:本网站为公益性网站,若单位或个人不同意刊载本信息请与本站联系。
版权所有:北京市农林科学院农业科技信息研究所
电 话: 010-12396(按0转人工) 地 址:北京市海淀区板井曙光花园中路9号
京ICP证090834号 京ICP备09045065号