您当前的位置:首页 >> 科技中心 >> 科技进展 >> 生物技术 >> 国内 >> 正文
低温木聚糖酶的研究进展
日期:2012-05-04 作者:马莉 迟乃玉 张庆芳 来源:《生物技术通报》.-2012,(1).-19-22 点击:
 

    木聚糖酶的底物木聚糖是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的可再生资源——半纤维素的主要组成部分,因此术聚糖酶在纸浆、造纸工业以及食品和饲料等各行业中都有广泛应用。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称,包括内切β-14-D-木聚糖酶(endo-β-14-D-xylanase)[EC 3.2.1.8],β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidases)[EC 3.2.1.37]α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidases)α-D-葡萄糖醛酸苷酶(α-D-glucuronidases)[EC 3.2.239]。但通常所说的木聚糖酶仅限于内切β-l4-D-木聚糖酶(xylanaseEC3.21.8),其作用是降解木聚糖主链骨架,是木聚糖降解酶系中较为关键的酶。

    与中、高温木聚糖酶相比,低温木聚糖酶具有更松散、柔顺的分子结构,使其在自然条件下具有更低的活化能、Km值及催化反应温度。这些特点可以加强其对底物的亲和力,提高底物利用率,从而降低能耗,缩短处理过程的时间;另外,利用低温木聚糖酶在高温条件下对热敏感的特点,可以通过温和的热处理使其变性失活,从而控制酶水解程度,使产品品质不受影响。这些优势都是中、高温木聚糖酶所无法比拟的。

    因此,鉴于低温木聚糖酶在降低生产成本及降低能耗方面的巨大优势,近年来对于低温木聚糖酶的研究正逐步深入。

1  低温木聚糖酶的来源

    目前发现的大多数低温木聚糖酶都是由低温生物产生的。因为这些生物体不需要温度调节,其内部温度与周围环境接近。尽管生化反应在低温下的负效应强烈,但是这些生物与常温环境中物种一样繁殖、生长和迁移。它们主要分布于两极区域(土壤、海水和海泥)、冰川、海底盆地,以及纬度较高的冻土区或特殊的低温环境等。

    尽管在地球上低温环境丰富而普遍,但是到目前为止,经过鉴定的能够产生低温木聚糖酶的生物种类却较有限,对低温木聚糖酶的研究更少。目前,已经发现的产低温木聚糖酶的生物均来自寒冷的南极环境,经过形态观察、生理生化试验及16S rDNA18S rDNA序列分析,这些生物包括3株革兰氏阴性细菌(Phaloplanktis TAH3aFlavobacterium frigidarium sp.novFlavobacterium sp.)、一株革兰氏阳性细菌(Clostridium strain PXYLl)、一株酵母菌(Cryptococcus adeliae)、磷虾(Euphausia superba)榨取液、一些真菌(Penicillum sp.,Alternaria alternataPhoma sp.2)和担子菌类(Coprinus psychromorbidus)等。

2  低温木聚糖酶的分子结构及适冷机制

2.1  分子结构研究

    虽然能够产生低温木聚糖酶的生物类群比较广泛,但到目前为止,人们只研究了6个低温木聚糖酶的性质,它们分别是来自p.haloplanktis TAH3a的第8家族木聚糖酶pXyl;来自C.adeliae的第10家族木聚糖酶XB;来自南极磷虾榨取液的木聚糖酶AB;来自Flavobacterium.sp.MSY2的木聚糖酶Xyn10,以及从环境基因组文库中筛选得到并进行异源表达的第8家族木聚糖酶Xyn8。关于这6个适冷木聚糖酶的来源、类别和基本性质(最适酶活温度和pH)的总结,如表1略所示。

    一般来说,酶的结构决定了酶的性质,对于不同来源、不同结构的酶,其具有的酶学性质也是不同的。近年来,随着基因技术和计算机比对技术的发展,根据疏水性聚类分析方法将木聚糖酶分为两个家族:F家族和G家族。其中也包括其他多聚糖水解酶类,如内且葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。字母分类中的F家族和G家族相当于数字分类中水解酶1011家族,分别包含高分子量和低分子量木聚糖酶。总之,第10家族的木聚糖酶的结构、理化性质较相似,但第11家族木聚糖酶在pIpH、热稳定性及酶分子的结构等方面相差较大。此外,还有一些木聚糖酶属于57843家族。而目前已研究的低温木聚糖酶主要集中在810家族。

    10家族木聚糖酶分子量较大,结构较复杂,整个三级结构外形似一个色拉碗,其催化区域为一个圆柱状(α/β)8。结构,催化部位位于碗底近C端的狭窄部位的浅沟中。该家族的木聚糖酶可作用于对硝基苯和对硝基苯纤维二糖,需较少数量底物结合位点,底物降解后的主要产物为低聚术糖。从山羊瘤胃内容物的环境DNA中克隆的木聚糖酶基因xynGR40编码的一种胞外低温木聚糖酶。这段全长1 446 bp编码481个氨基酸残基的多肽,包含一个催化结构域,属第10家族。该xynGR40蛋白除具有第10家族糖苷水解酶的典型结构外,还具有更少的氢键和盐桥,且在催化结构域有延长的环状物,从而使该酶在常温下有较好的稳定性,并且比第10家族里其他的低温木聚糖酶具有更高的催化效率。

    目前发现属于第8家族的木聚糖酶较少,其典型的结构还有待进一步研究。来自南极细菌——交替假单胞菌的低温木聚糖酶就属于第8家族。其褶层不同于其他已知的木聚糖酶,通过考核各种可能解释适冷特性的参数,显示该蛋白具有较少的盐桥和较多裸露的非极性残基。

2.2  适冷机制的研究

    低温木聚糖酶较中高温木聚糖,具有两个显著的特征:一是在低温下具有较高的催化效率;二是对热很敏感。这两个特征与低温木聚糖酶的分子结构有密切的关系。

    木聚糖酶分子由催化区(catalytic domainCD)、纤维素结合区(cellulose-binding domainCBD)、木聚糖结合区(Xynl)、连接序列(linker sequence)和其他未知功能的非催化区组成。与中高温木聚糖酶相比,目前已研究的低温木聚糖酶分子结构并未发生很大的构象改变,其总的折叠方式较接近于中高温木聚糖酶,这表明低温木聚糖酶总催化机理和反应方式没有改变。它主要是通过其CD的变化以及氢键和盐桥的修饰,从而使其在低温环境下亦具有较高的酶活和更高的分子柔性。

    从低温下的高催化效率方面来讲,低温木聚糖酶通过多种途径使其催化腔变大,包括催化部位边缘变小或删除,用具有短侧链氨基酸残基取代在催化腔入口处具有长侧链氨基酸残基等。催化腔变大可以使低温木聚糖酶在结合底物时消耗更少的能量完成构象变化,从而降低酶与底物形成复合物时所需的活化能;同时,较大的催化腔也易于产物的释放。另外,通过改变CD的结构使酶在低温下Km值降低,从而提高低温下的催化效率,也是其适应低温的一条途径。

    低温木聚糖酶的稳定性及柔性与中高温木聚糖酶相比,其分子中氢键和盐桥的数量大大减少,或其表面有更多的非极性残基暴露在溶液中。这些结构因素的改变减弱了该酶分子的刚性,提高了其柔性,降低了其稳定性,使酶对热较敏感。

3  基因克隆与表达

    对于常温木聚糖酶的基因克隆和表达的研究较多。到目前为止,已有多种微生物的木聚糖酶基因得到了分离克隆。而对低温木聚糖酶的基因研究尚在起步中,主要是利用基因克隆和表达技术实现低温木聚糖酶在常用微生物宿主的表达。利用此技术进行菌种选育,可直接得到酶基因,避免了繁琐的菌种筛选工作,大大减少了工作量,缩短了从探索研究到应用的时间,克服了传统育种方法的盲目性;同时,低温木聚糖酶基因在常规微生物宿主中的表达,便于得到较高产量的目的酶蛋白,而且能够改变酶的性质,使多种有利特性集中到一株菌种上,从而更利于其工业化的应用。

    Lee等舍弃传统的育种方法,直接从环境DNA文库中克隆得到低温木聚糖酶基因xyn8,以纯化的噬菌体质粒为载体,将得到的xvn8基因片段整合入质粒载体中,并将载体导入大肠杆菌BL21中,实现xyn8基因的表达。成功表达的目的酶蛋白由399个氨基酸残基构成,分子量为45.9kD,且属于糖苷水解酶第8家族。对纯化的酶进行酶学性质研究,该低温木聚糖酶最适反应温度为20,并在更低的温度下保持着较为可观的酶活性。

    Guo等从海洋细菌Glaciecola mesophila KMM 241中克隆得到基因xynA,该基因长1271bp,编码423个氨基酸残基组成的低温木聚糖酶。重组子XynA在大肠杆菌BL21中得到表达,表达产物分子量为43 kD。对纯化的表达产物进行酶学性质研究,该低温木聚糖酶最适反应温度为30,最适反应pH7.0,在4下仍具有23%的酶活性和27%的催化效率,其Tm44.5

4  低温木聚糖酶的应用

    木聚糖酶的工业化应用始于20世纪80年代,最初应用于饲料,而后扩展到食品、纺织和造纸工业。近年来,术聚糖酶在制浆造纸、食品及饲料等行业都有广泛的应用。低温木聚糖酶由于在中低温下具有较高的催化效率,且热稳定性较低,使其在某些工业应用中具有优势。主要体现在两个方面,一是在某些需要中低温条件下低温木聚糖酶可以发挥其高活性的特点;二是可以通过升高温度使低温木聚糖酶快速失去活性,从而可以比较容易控制反应过程,保证产品的风味和质量。

    目前对于低温木聚糖酶的应用较少,主要集中于食品工业,尤其是在果汁榨取和面包烤制等方面。在面包烤制过程中,生面团制备过程通常在低于35的条件下进行。最近也有研究表明来自南极的交替假单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis TSH3a)的第8家族低温木聚糖酶pXyl在面包烤制上比一种普遍应用的商业化中温术聚糖酶更有效。

5  展望

    目前对低温木聚糖酶的研究而临的最大问题是产量较低,酶活性不高。现在采用菌种筛选和基因工程手段来提高酶活和产量,使问题得到了缓解。但要有关键性突破还要做很多工作。可从如下方面进一步研究:(1)低温木聚糖酶的来源。目前,菌种的自然选育仍是得到酶产物的主要途径,但因筛选工作具有一定的概率性,使得整个工作周期延长,工作量加大。为此,可采用直接从环境DNA文库中克隆酶基因的方法,再通过常规的宿主菌进行表达,不仅减少了工作量,而且还能在较短时间内得到大量低温木聚糖酶产品。(2)工程菌的构建。随着各种分子生物学技术的发展和应用,低温木聚糖酶基因克隆和工程菌的构建将成为低温木聚糖酶研究的热点。(3)多菌株混合发酵。混合发酵有多种微生物分泌的酶系参与、水解和发酵混合进行,其中多菌共生酶系可以互补,从而促进酶产量的提高。

    总之,虽然目前低温木聚糖酶在工业中的应用并不广泛,但由于其具有工艺流程简化、节约成本和耗能低等巨大优势,相信随着对其研究地逐步深入,必将在工业上有着广阔的应用前景。

    作者单位:(1.大连大学生物工程学院,大连 1166222.辽宁省海洋微生物工程研究中心,大连 116622)

    文章采集:caisy

    注明:国家“863”子课题计划项目(2007AA021306

注:本网站为公益性网站,若单位或个人不同意刊载本信息请与本站联系。
版权所有:北京市农林科学院农业科技信息研究所
电 话: 010-12396(按0转人工) 地 址:北京市海淀区板井曙光花园中路9号
京ICP证090834号 京ICP备09045065号