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紫花苜蓿转基因技术及其应用的研究进展
日期:2013-04-28 作者:周岩 张洁 袁重要 马俊 来源:生物技术通报 点击:
 
 
紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是栽培最早、利用最广泛的豆科多年生牧草,是重要的优良牧草作物之一,在我国已有 2 000 多年的栽培历史。目前全世界苜蓿种植面积达 3 000 万 公顷,我国种植面积约为 280 万 公顷[1]。苜蓿因其适应性强、产量高、适口性好、各类家畜喜食、营养价值居各种牧草作物之首,被誉为“牧草之王”。苜蓿不仅是重要的饲料作物,而且可以改良土壤、保持水土,起到保护生态环境的重要作用。传统的育种方法时间长,成本高,且可利用的种质资源也有一定局限性,已不能满足育种目标多样化的需求。随着植物基因工程技术的迅猛发展和广泛应用,植物转基因技术在苜蓿遗传改良方面发挥着越来越重要的作用。与传统育种相比,植物基因工程技术具有周期短、选择精度强、育种效率高以及克服远缘不亲合性等优点,可大大加速育种进程,已成为苜蓿遗传改良发展的重要方向。
1紫花苜蓿转基因技术及其研究进展
自从 1986 年首例农杆菌介导苜蓿转基因成功以来,苜蓿转基因技术在基础理论研究、技术方法和分子育种实践中不断丰富和完善,并取得了长足进展。目前,常用于紫花苜蓿转化的方法有农杆菌介导法、电击法、显微注射法及基因枪法等。
1.1 农杆菌介导法
农杆菌介导法是应用最早、最广泛、获得转基因植物最有效的转化方法。相关研究资料丰富,成功的实例较多。利用农杆菌介导法转化受体,操作易行,经济简便,整合于基因组上的外源基因拷贝数少且重排程度低,转化效率高是目前紫花苜蓿分子改良较常用的方法。农杆菌介导法能够建立稳定的遗传转化,其原理是 :土壤农杆菌可以侵染所有受伤的双子叶植物和少数单子叶植物,农杆菌侵染植物时,受植物所释放的酚类物质诱导,质粒上 Vir区基因表达,可将质粒上 T-DNA 整合到植物的基因组中,在植物体内表达,以改变植物的遗传性状。由于农杆菌具有天然的转移 DNA 特性,因此被广泛应用于植物基因工程中。根癌农杆菌的 Ti 质粒系统是目前研究较多,理论基础较清楚,技术方法较成熟的苜蓿基因转化途径[2]。
早在 1986 年,Deak[3]就通过农杆菌转化法将npt Ⅱ 基因成功地导入苜蓿,获得了可育的抗性植株。Zhou[4-8]利用根癌农杆菌介导法将 HD-Zip 基因正义、反义片段转入苜蓿中,并利用转基因苜蓿对该基因的生物学功能进行初步探讨。陈晨等[9]利用农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化研究,将从盐生杜氏藻中克隆到的抗逆基因 Dschr 导入紫花苜蓿培种“中苜一号”,获得了 52 个转化株系。赵红娟[10]以“新牧 1 号”杂花苜蓿和新疆大叶苜蓿为材料,通过根癌农杆菌介导转化犁苞滨藜耐盐基因 NHX,提高了植株耐盐性。化烨[11]采用农杆菌介导法对肇东苜蓿进行遗传转化,获得了大量含有耐盐基因GsSAMS 的抗性植株。王鸣刚等[12]利用农杆菌介导法将拟南芥的 AtPCS1 基因成功转入陇东苜蓿中,获得转基因植株。随后,他们又利用转化的农杆菌EHA105 将该基因侵染甘农一号苜蓿叶片,经筛选后获得 57 株再生转基因植株,随机抽取其中 9 株进行 PCR 检测,6 株为阳性。初步结果表明,AtPCS1基因已整合到苜蓿基因组中[13]。Liu 等[14]通过农杆菌介导法将 BADH 基因导入紫花苜蓿,42 株材料经 RT-PCR 检测到外源基因 BADH 在转录水平成功表达,Southern 杂交结果显示目的基因已整合到苜蓿基因组中 ;研究还发现 T1 代转基因苜蓿 POD 和SOD 酶活力较野生型有所提高。
1.2 电击法 
电击法是利用植物原生质体具有整合和表达外源 DNA 的能力,把植物细胞脱壁,通过电极放出的电脉冲刺激植物细胞而造成原生质体细胞膜出现微孔,分布于原生质体周围的外源 DNA 即可进入原生质体内。黄绍兴等[15]用电击法将 GUS 基因直接导入紫花苜蓿根原生质体并获得转基因植株。GUS 酶活性检测结果表明,GUS 基因在转化的紫花苜蓿细胞内存在和表达,转化频率为 6.5%。但该方法的应用受诸多因素的限制,如植物原生质体再生系统的建立十分困难,转化率很低,体细胞无性系变异较大等,其相关报道较少。
1.3 显微注射法
显微注射法是一种物理转化方法,该方法简单、转化率高,适用于各种材料,无局限性。由于整个操作过程对受体细胞无毒害作用,有利于转化细胞的生长发育,培养过程也不需特殊的选择系统,因而其在动物细胞或卵细胞的基因转化、核移植及细胞器的移植方面应用较多,并已经取得重要成果[16]。Reich 等[17]用显微注射法将 Ti 质粒导入紫花苜蓿原生质体,获得转化的愈伤组织,转化率为 15%-26%。但该方法对仪器设备、操作技术、培养环境要求较高,注射时费工费时,因而效率较低,所以此法未得到广泛使用,相关研究报道也较少。
1.4 基因枪法
基因枪法是由康乃尔大学 Sanford 等在 1987 年建立的基因导入方法,是将外源 DNA 或 RNA 吸附包囊在直径约 1-2 mm 的金粉或钨粉颗粒表面上,经动力加速轰击植物外植体的靶组织,使之穿过转化受体的细胞壁和细胞膜,最终使外源基因整合到植物基因组中的方法。基因枪转化法操作简单易行,受体组织或器官的范围较广,无明显的宿主限制,外源基因直接进入可再生细胞团中,只需良好的组织培养技术,即可获得再生植株[18]。但其对设备有特殊的要求,对植物组织损坏严重,转化频率低且插入的外源基因多为多拷贝,易导致基因沉默[16]。
国外利用该方法进行遗传转化的报道较多,在近几年的相关文献中我国用此方法进行的研究很少。Pereira 等[19]利用基因枪法将含 nptII 基因的质粒导入 7 个不同品种的苜蓿中,在子代中检测到该基因的存在,并发现用该法对苜蓿进行转化与基因型无关。Ramaiah 等[20]用基因枪法转化苜蓿花粉,将报告基因 GUS 导入其中并成功表达。随后利用该花粉对雄性不育植物进行授粉,获得具有繁育能力的种子,通过 PCR 和 Southern 杂交技术对种子幼苗进行分析,发现 30% 的幼苗有 GUS 基因的整合。王瑛[21]将大麦的 lea3 基因通过基因枪法导入紫花苜蓿“中苜 1 号”的胚性愈伤组织中,PCR 分子检测证明,lea3 基因已整合到紫花苜蓿的基因组中 ;与对照植株相比,获得的转基因植株具有显著增强的耐盐能力。除以上 4 种转基因方法外,将外源 DNA 导入植物细胞的方法还有很多,如花粉管通道法、聚乙二醇法等。
2利用转基因技术遗传改良紫花苜蓿的研究进展
利用转基因技术进行苜蓿遗传改良的研究主要包括改良苜蓿品质、提高抗逆性、抗病虫害及抗除草剂等方面。
2.1 品质改良
营养价值及消化率是牧草品质最主要的评价指标,是影响家畜生长发育以及畜产品质量的重要因素。因此,提高苜蓿的品质应主要从提高其蛋白质和缩合单宁含量,降低木质素、提高牧草的消化率等方面对苜蓿进行改良。
2.1.1 提高含硫氨基酸的遗传转化 羊毛的生长与含硫氨基酸的含量密切相关,提高含硫氨基酸在饲料中的含量能够显著增加羊毛的产量。但苜蓿作为牧草饲料,其蛋白质中的含硫氨基酸的含量较低。为了提高羊毛的产量和质量,人们利用转基因技术已将富含含硫氨基酸的蛋白编码基因转入苜蓿中,使其过量表达,以增加苜蓿中含硫氨基酸的含量。Tabe 等[22]将富含含硫氨基酸的向日葵种子清蛋白基因成功转入苜蓿中,检测结果显示转基因苜蓿中含硫氨基酸蛋白占叶片可溶性蛋白的 0.1%。吕德扬等[23]通过农杆菌介导法将硫氨基酸蛋白基因 HNP导入紫花苜蓿中,由子叶诱导转基因植株再生成功。经分析表明转化植株的含硫氨基酸含量比对照植株显著提高。玉米蛋白(Zein)中含有较多的含硫氨基酸,Bagga 等[24]成功地将控制玉米蛋白表达的CaMV35S-β-zein 和 CaMV35S-δ-zein 基因分别导入苜蓿,苜蓿蛋白中含硫氨基酸的含量明显提高。
2.1.2 提高缩合单宁的遗传转化 家畜在喂食苜蓿时常患有臌胀病,导致苜蓿的营养价值流失。该病与苜蓿体内缩合单宁的含量过低有关。缩合单宁与水溶性蛋白质结合,降低其水溶性,使蛋白质在瘤胃内消化速度减慢以避免大量泡沫的产生,从而消除臌胀病的危害。Sharma 等[25]于 2002 年从一年生蒺藜状苜蓿和拟南芥中已分离出缩合单宁基因,这标志着利用基因工程技术预防反刍动物臌胀病的研究已经起步。尽管已有将参与单宁合成的基因转入紫花苜蓿的尝试,但迄今为止,尚无抗臌胀的转基因苜蓿品种推出[1]。
2.1.3 降低木质素的遗传转化 苜蓿的细胞壁中存在大量的木质素,不易消化,牲畜在食用苜蓿之后常常出现消化不完全的现象,从而影响了牲畜对营养物质的吸收和利用。苜蓿中的木质素的含量越高,牲畜对其的消化率就越低,苜蓿的营养品质就越低。因此,获得木质素含量较低的苜蓿新品种是该领域长期以来的研究热点。Baucher 等[26]采用反义 RNA技术,成功得到了肉桂酸脱氢酶(CAD)负调控的转基因苜蓿,在转基因苜蓿植株中,此酶活性降低,使细胞壁中木质素的降解性和苜蓿的消化率都有所提高。Jackson 等[27]对紫花苜蓿进行转化,降低了木质素合成途径中的 CCR 与 CAD 的酶活性,从而显著降低了叶片中木质素含量,提高了苜蓿的干物质消化率。
2.2 提高苜蓿抗逆性的遗传改良
苜蓿的抗逆性研究主要包括耐寒、耐盐、耐铝等方面,提高苜蓿的抗逆性有利于苜蓿的广适性。
2.2.1 提高苜蓿耐寒性 低温环境严重影响苜蓿的地理分布和生产产量,在高纬度寒冷地区,低温是导致苜蓿产量降低、甚至死亡的关键因素。目前,转基因技术的发展为培育抗寒、越冬能力强的苜蓿新品种提供了一条崭新的途径。有研究表明,过量表达超氧化物歧化酶 SOD 的转基因苜蓿具有更好的耐寒能力,可减轻冻害[28]。Mckersie 等[29]首次将烟草的 Mn-SOD 基因转入苜蓿,提高了转基因苜蓿中 SOD 酶活性,同时苜蓿受冻害后迅速恢复的能力也有所加强。刘晓静等[30]利用农杆菌介导抗冻基因 CBF2 转化和田苜蓿,现已得到转基因的苜蓿愈伤组织。
2.2.2 提高苜蓿耐盐性 土壤盐碱化是目前制约农业发展和影响生态平衡的严重问题之一。苜蓿在改良土壤结构与成分过程中发挥着重要作用,但其耐盐能力较弱,很难适应高盐的生长环境。随着分子生物学的发展,人们通过转基因技术培育耐盐性的紫花首蓿品种,对于改良和利用我国西北地区大面积盐荒地,促进该地区畜牧业的发展以及生态环境的改善都具有重要意义[31]。我国在耐盐碱基因的分离、克隆和转化等方面的研究也取得了一定进展,克隆了耐盐碱的相关基因[32]。Winicov 等[33]将Alfin1 基因导入苜蓿中,增强了盐诱导的 MsPRP2基因的表达,在植株的生长过程中耐盐性提高。包爱科等[31]将拟南芥基因 AVP1 转入和田苜蓿使其超表达,最终获得具有较强耐盐性紫花苜蓿品种。刘小琳[34]将 MsNHX1 基因转入紫花苜蓿“中苜 1 号”,获得耐盐性苜蓿材料。殷东旭[35]利用根癌农杆菌介导法将含有 SsNHX1 和 PDH45 基因的植物双元表达载体导入到苜蓿中,SsNHXI 与 PDH45 基因显著提高了紫花苜蓿的耐盐性。李望丰[36,37]成功地将猪毛菜液泡膜型 Na+/H+逆向转运蛋白基因 SsNHX1导入苜蓿基因组中,Southern 杂交证实 203 株为阳性植株 ;经进一步研究发现,过量表达 SsNHX1 基因的转基因苜蓿能够在 400 mmol/L NaCl 的环境中生长多于 50 d,其耐盐性是目前为止转基因植物报道的最高水平。周岩实验室于 2011 年将 SeNHX1 基因导入金皇后、牧歌、三得利、阿尔冈金、爱菲尼特和维多利亚 6 个苜蓿栽培品种中(数据待发表)。
2.2.3 提高苜蓿耐铝性 苜蓿对铝的毒害敏感,在酸性土壤中可溶性铝的含量较高,抑制根部发育,导致根系外形短小,从而影响作物对水分和营养的吸收,使苜蓿产量降低。大量研究表明,植物根系分泌的有机酸含量与植物耐铝性有密切关系。Tesfaye 等[38]研究表明超表达苹果酸脱氢酶(MDH)的转基因苜蓿对铝的抗性得到明显增强,对酸性土壤和高铝土壤的抗性增加。罗小英等[39]将 neMDH基因通过新建立的转化体系导入苜蓿,表明超量表达 neMDH 基因可提高转基因苜蓿对铝毒的耐受性。刘洋等[40]将从棉花中克隆得到的铝诱导蛋白基因 GhAlin 成功转入紫花苜蓿,并对转基因植株的耐铝效果进行鉴定,结果表明转基因植株的根系在 25 μmol/L Al3+处理 7 d 后,根的相对生长量明显高于对照,侧根发育明显,根尖伸长区根毛明显多于对照,表明所转基因具有一定的耐铝作用。甘智才[41]对转柠檬酸合成酶基因的苜蓿耐铝性进行研究,结果表明,渝苜 1 号 CS 转基因苜蓿的耐铝条件为 AlCl3浓度 15-30 μmol/L,处理 2 d ;转基因苜蓿相对于对照株表现出明显的耐铝性。
2.3 抗病虫害基因转化苜蓿的遗传改良
近年来利用转基因技术培育抗病虫苜蓿的遗传改良研究已取得重要进展。Thomas[42]将烟天蛾的抗弹性蛋白抑制剂基因 P1 导入苜蓿,使植物对咀嚼昆虫的毒杀作用更加明显。熊恒硕等[43]将含有CryIA(a)/CryIA(c)、半夏凝集素(pta)的双价抗虫载体转入紫花苜蓿品种“中苜 1 号”,以期获得兼抗同翅目及鳞翅目害虫的新种质。目前已初步获得阳性转化植株,有关抗虫性的鉴定正在进行。在抗病研究方面,已将苜蓿的葡聚糖酶基因 Aglul 转入苜蓿后,发现超量表达 Aglul 的植株已表现出对根霉疫腐病的抗性[44]。Hipskind 等[45]将花生的白藜芦醇酶基因导入苜蓿,在转基因苜蓿中产生化合物Rgluc,提高了苜蓿对轮纹病的抗性,能够在一定程度上抑制苜蓿坏斑病、失绿现象及病原孢子的繁殖。
2.4 抗除草剂基因转化苜蓿的遗传改良
在使用除草剂进行田间除草时,由于其残留期较长,对作物生长、人畜健康可产生不利影响。通过基因工程对苜蓿进行抗除草剂基因转化是解决这个问题最有效的方法。D’Halluin 等[46]将除草剂Basta 和 Heihac 的抗性基因 Bar 导入苜蓿中,检测到转基因植株对除草剂 Basta 具有抗性。刘艳芝等[47]将抗除草剂草丁膦 Bar 基因导入“草原 1 号”苜蓿,叶片筛选结果表明转基因植株对除草剂 Basta 具有明显的抗性。美国用基因工程方法培育的抗 Basta 除草剂苜蓿品种现已完成田间安全性评估,它可能成为世界上第一个用于大田生产的转基因牧草品种[16]。
2.5 转基因紫花苜蓿作为生物反应器
近年来,植物生物反应器已成为生物技术领域新的研究方向,转基因紫花苜蓿作为生物反应器在生产植物疫苗、酶制剂和药用蛋白等方面具有广阔的市场前景和商业价值,目前已取得一定进展。
2.5.1 植物疫苗 利用转基因植物生产疫苗不但可以改变传统的疫苗生产方式和接种手段,而且会大大降低疫苗的生产成本[48],已逐渐受到人们的重视。其中,利用转基因植物生产口服疫苗是研究的热点之一。有关转基因苜蓿生产疫苗的报道较多。早在1999 年 Wigdorovitz 等就首次报道了利用转基因牧草作为口服疫苗使动物产生免疫反应的研究。2003 年,黎万奎等[49]将肝片吸虫保护性抗原基因 FH3 成功导入苜蓿基因组中。Raymond 等[50]将 gs6054-gfp 荧光蛋白融合基因导入紫花苜蓿中,转基因植株可以稳定地生产 Gs60 抗体 Gs6054,用含有该抗体的苜蓿饲养兔子,兔子对巴斯德杆菌性肺炎的免疫能力明显提高。杨国锋等[51]研究建立农杆菌介导小反刍兽疫病毒 PPRV 的 F 基因苜蓿转化体系,为制备预防小反刍兽疫的转基因牧草疫苗奠定基础。
2.5.2 酶制剂 利用苜蓿生产工业酶产品产量高,但花费相对较少。美国农业部研究人员在非反刍动物饲料中添加了从转基因苜蓿中提取的肌醇六磷酸酶(植酸酶),发现动物对磷的吸收率提高到 42%左右,从转基因苜蓿中提取这种酶比传统发酵提取更便宜。苏玉春[52]通过农杆菌介导法将木聚糖酶xynB 基因成功导入苜蓿中,DNS 方法检测转基因植株的木聚糖酶活性为 10.5 U/g 鲜叶片,为通过微生物发酵生产酶制剂提供一种方法,同时也为满足日益增长的工业酶制剂需求寻找新的途径。
2.5.3 抗体 苜蓿也可用来生产诊断用单克隆抗体。
早在 1999 年,Khoudi 等[53]将人类免疫球蛋白基因 IgG 导入紫花苜蓿中,旨在生产单克隆抗体,结果显示,转基因苜蓿能够合成有活性的免疫球蛋白,功能与通过杂交瘤生产的抗体效果相同,而且经过多次的收割和烘干,干草中的抗体含量仍保持稳定。
3苜蓿转基因技术存在的问题
3.1 转化效率低
目前,转基因技术存在转化率低、随机性大、重复性差等问题。目标基因来源狭窄、高表达启动子和有效载体的缺乏等因素限制了转基因技术的发展、应用和推广。另外,紫花苜蓿是同源四倍体,其再生体系的建立受基因型影响较大,再生频率不稳定,获得再生植株周期较长。因此,需要进一步发展和完善苜蓿转基因技术,建立高频再生的苜蓿遗传转化体系是苜蓿生物育种亟待解决的关键问题。
3.2 转基因苜蓿安全性问题
转基因苜蓿的安全性问题主要包括环境安全和食品安全。苜蓿通过转基因技术获得诸多抗性,在生态系统中,可能会改变生物种群,对生物物种多态性、生态平衡等产生影响。基因漂移现象会引起苜蓿近缘野生品种获得这些目的基因,可能产生“超级杂草”。 此外,生物存在共同进化的现象,具有抗病虫能力的转基因苜蓿在逆境环境中能够抵御病虫害的威胁得以生存,然而病虫也会迅速对不良的生存环境产生反应,获得适应性,从而使转基因苜蓿对病虫的抗性逐渐丧失,生态系统稳定性也随之遭到破坏。同时,转基因植物的食用安全性也倍受关注。转入的目标基因表达产物可能对人体产生过敏性物质,转基因操作可能引发植物体内内源过敏性物质提高,或导致植物产生新的过敏性物质[54]。
常用的抗生素抗性标记基因通过食物链进入人体,是否会使人体对抗生素药物产生抗性,影响疾病的治疗效果,还有待进一步研究和讨论。
4结语
近些年来,利用转基因技术对紫花苜蓿进行遗传改良取得了显著成就,如耐盐、耐寒、抗病虫等基因均被成功导入紫花苜蓿,培育出了一些新品种,产生了显著经济效益,大大推动了苜蓿分子育种的发展进程 ;利用转基因苜蓿作为生物反应器,生产植物疫苗、酶制剂以及抗体等研究日趋完善,具有较好的发展前景和商业价值。但在我国,苜蓿转基因研究起步较晚,发展缓慢,多数研究都止步于实验室的理论基础性研究,商业推广与产业化应用还不够广泛。因此,在转基因技术不断完善的同时,还需要加强产业化投入,奠定转基因苜蓿商业化的基础。另外,应进一步深入研究转基因苜蓿的分子机制,降低转基因苜蓿可能对生态系统造成的危害,重视和正确评价转基因的生物安全问题。
 
参考文献:(略)
 
采编:guoq
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