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CRISPR/Cas技术实现拟南芥中染色体结构的改变
日期:2020-11-10 作者:未知 来源:Plant Biotechnology Journal 点击:
 每个生物体中遗传信息的变异性是生态系统中广泛生物多样性的基础。除了简单的突变导致一个或多个碱基的改变外,在不同物种的进化过程中还可以反复观察到染色体结构的变化。特别是染色体片段方向的改变(例如倒位),与物种形成、适应和基因组进化有关。染色体倒位是在不同的植物分离株或品种之间反复发生的重排。这种倒位可能是进化中生殖隔离的基础,也是经典育种的一个主要障碍,因为在同源染色体上的倒位序列之间无法观察到交叉(crossovers,COs)。
近日,德国卡尔斯鲁厄理工学院的Holger Puchta团队在Nature Communications 上发表了题为“Changing local recombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosome engineering”的研究成果,描述了 Col-0 中 hk4S 倒位的逆转,并利用来自金黄色葡萄球菌的高效 Cas9 核酸酶在各自区域的品种之间恢复 CO。
    通过比较两个拟南芥生态型Columbia (Col-0)和Landsberg errecta (Ler-1)的基因组序列,可以检测到许多倒位。其中最著名的是 hk4S 倒位,大小为1.17Mb,致着丝粒异染色质 knob 区域转移至 4 号染色体短臂的中间。而 Ler-1 中的 4号染色体表进化较早的构象,Col-0 对应的 4 号染色体带有 hk4S 倒位。
   首先,作者利用现有的序列信息识别了合适的原间隔序列,这些序列位于两个原始反转结附近。此外,为了避免周围基因的干扰,确保了所选的原间隔区位于基因间区域(根据其对着丝粒的定位,命名为近端原间隔区(p PS)和远端原间隔区(d PS))。所用的两个原间隔区都被放置在靠近原始 hk4S d 结的 kb 范围内。在卵细胞特异性 EC1.1/EC1.2 启动子的控制下,用 Sa-Cas9 克隆到pDe-Sa-Cas9 载体中,最终转化为 A.thaliana Col-0 野生型植物。并通过对 38个初级转化子代的筛选,作者获得了 7 个独立的 Mb 大小的倒位事件,总的频率约为 0.5%,成功地实现了 hk4S knob 的倒转。
接下来,作者测试了是否能够通过 CRISPR/Cas 诱导的 hk4S knob 倒位来重新激活与 Ler-1 杂交的先前 CO 区的重组。作者将 Ler-1 与 rknob-1 杂交,并用Col-0 野生型植物与 Ler-1 杂交作为对照。重组频率利用 SNP 的基因分型,通过使用七个标记来区分 Col-0 和 Ler-1 来确定。标记 2 和标记 6 位于倒位的外部,但直接靠近倒位连接处,距离只有几百个碱基对,代表倒位的两个边界。
    首先,作者分析了倒位区的单倍体花粉。在开花期收集杂种F1的花序,通过流式细胞仪分离花粉核,进行全基因组扩增。作为质量控制,作者检测了3个不同区域是否存在 SNP 标记,以识别成功扩增的花粉 DNA。然后,确定了5个间隔的CO频率。在倒位线的54 个样本(rknob-1×Ler-1)中,作者检测到3个均匀分布在倒位区域上的独立CO事件,而在90个对照样本中,没有在倒位区域内检测到CO事件。为了证实后代的这些结果,作者利用SNP的基因分型测试了6株杂种 F2 植株的CO形成。用与F1分析相同的引物和探针对 rknob-1×Ler-1 系198 株 F2 和对照组200株F2植株测定了CO。总体而言,作者在 rknob-1×Ler-1系的染色体臂中检测到9个CO事件,在倒位中检测到 27个CO 事件,在着丝粒附近没有CO事件。因此证明,通过恢复knob倒位,作者恢复了4号染色体先前
不可接近部分的CO形成,并改变了重组模式。
    本文研究表明,利用金黄色葡萄球菌中Cas9核酸酶的卵细胞特异性表达,可以实现 1.1Mb 长 hk4S 倒位的靶向逆转。通过将带有重排的 4 号染色体的 Col-0与 Ler-1 杂交,减数分裂交换可以恢复到以前没有检测到的遗传交换的区域。昭示了打破遗传连锁的体细胞染色体工程策略在植物育种中具有巨大的应用潜力。
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