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海洋微生物抗菌活性产物研究进展
日期:2012-10-10 作者:刘伟, 徐涛,蔡敬民,潘仁瑞 来源:包装与食品机械 点击:
 
海洋占地球表面积的71%,生物量约占地球生物总量的80%,其中除了人类熟知的鱼、虾、贝类等生物外,仅较低等的生物种类约20多万种,是地球上最大的资源能源宝库,丰富的资源有待于人们研究利用。目前人们对海洋生物的认识仍相当有限,利用率仅1%左右。海洋生物的特殊生境意味着海洋生物的新陈代谢和生存繁殖方式的特殊性,从而产生许多结构特殊的生命活性物质和代谢产物[1, 2, 3]。
美国是较早注意开发海洋生物资源的国家之一。上世纪六十年代初BurkholderPR利用哥伦比亚大学的Lamont地质观察站建立了海洋生物学计划[4]。从南极洲和地处加勒比海热带波多黎各岛邻近海域采样分离出151株微生物[5]。其中一株假单胞菌Psendomonas bromoutilis产生一种新的吡咯化合物抗生物质,对G+菌有很强的抑制作用[6]。这一报道标志着从海洋微生物寻找新的抗生物质的可能性。近年来的研究发现,由于海洋与陆地生态环境的极大差异,使得海洋生物与陆地生物相比更加多样和丰富。海洋微生物来源新化合物数量以令人难以置信的速度被发现,并且不断有新骨架的化合物被报道[3]。
1 海洋微生物活性产物的研究进展
刘晶晶等对2000年前后已报道的海洋微生物产生的重要活性物质进行综述[7]。2000~2004年报道的细菌和放线菌产生新抗生物质的简况如表1(略)所示。
国内很早就使用海洋生物治疗疾病,一些中医经典书籍(《黄帝内经》,《神农本草经》,《本草纲目》等)都记载了大量的生物药,如牡蛎,珊瑚,海藻等。但从海洋微生物中寻找抗生物质的研究则起步较晚,黄维真等报道[8]在福建鼓浪屿沿海的海泥中分离出一株海洋放线菌———鲁特格链霉菌鼓浪屿亚种( Str. rutgersensis subsp. gulan-gyunensis),它产生广谱、低毒性的抗生物质Mino-biosamine和肌醇胺霉素等,对绿脓杆菌和一些耐药性G-菌具有较强的抗性。王书锦等[9]在黄海、渤海、辽宁近海地区采样,分离出5608株海洋细菌,测定表明,约有25%的菌株具有不同程度的抗病原真菌、病原细菌的能力。刘全永等[10]从海洋细菌LUB02中分离出广谱抗真菌活性物质,对人和动物条件病原菌白色念珠菌(Candida albi-cans)有较强的抑制作用。2006年谷俊等[11]从连云港沿海海泥中分离出一株放线菌M324,其代谢产物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有抗菌活性。同年崔洪霞等[12]从胶州湾采集256株链霉菌,对其进行抗菌活性的筛选,发现有22%的海洋链霉菌具有不同的抗性,并对M095的代谢产物进行分离,得到金霉素,对金黄色葡萄球菌和丝状真菌毛霉均有显著的抑制作用。王莹、吴根福报道[13]从东海温州海域采样,分离出195株海洋细菌,筛选出22株菌具有抗菌活性。
2002年Woo等[14]从海洋链霉菌A477发酵液中得到一种160kD的蛋白质SAP,对真菌具有强烈的抑制作用。2003年Robert等[15]从夏威夷浅海淤泥中分离出一株链霉菌BD21-2,分离出一新化合物Bonactin,对G-、G+和真菌具有抑制作用。2004年Reidinger等[16]从日本深海的海泥中分离出小单胞菌AB-18-032菌株,并从代谢物中分离出新抗生素Abyssomicins,对耐药的MRSA具有抑制活性。2005年Irma等[17]从海泥中分离出一株链霉菌MAR4,从代谢产物中分离出3种新的萜类化合物对耐药性的MRSA和肠杆菌都有抑制作用。2007年Venkat等[18]从关岛海泥中筛选一株放线菌NPS008920,经鉴定属于新属Marinispora,产生3种新化合物LipoxazolidinoneA,B和C,对葡萄球菌等多种致病菌均有抑制活性。2008年Katherine等[19]从加利福尼亚州圣地亚哥的海泥中分离出一株新放线菌NPS12745,从代谢产物中分离出一组吡咯类化合物lynamicinsA-E,对G+和G-均具有抗菌活性,尤其对耐药性的MRSA和肠杆菌活性较好。
相对于海洋细菌和放线菌,海洋真菌活性成分的发现相对稍晚,到了上世纪80年代中期才开始有少量报道,第一个报道的海洋真菌抗生素是Leptosphaerin。2002年Daferner[20]从真菌Zopfiel-la latipes CBS61197中得到两个化合物Zopfiel-lamidesA、B,其中前者对G+具有较强的抑制作用。同年Jadulco等[21]从海绵Niphates olemda分离到一株真菌Curvularia lunata,从代谢产物中得到3个化合物: cytoskyrin A, abscisic acid和luna-tin,它们对多种细菌均有抑制作用。2009年E.Dilip de Silva[22]从新泽西海域分离的真菌Peni-cillium sp.的代谢产物中分离到化合物PF1140和Akanthomycin,前者对枯草杆菌和白色念球菌有抗性,后者对金黄色葡萄球菌具有活性。同年KongkiatTrisuwan等[23]从海洋真菌Nigrospora sp.PSU-F18中分离出Pyrone,对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
近年来我国对海洋真菌生物活性物质报道逐渐增多。2005年赵玲玲等[24]从3株9F系列海洋真菌中分离得到4个化合物,分别是transdehydro-curvularin, terrein, paxilline和citreopyrone,对稻瘟病菌P22b均有不同程度的抑制活性。2007年郭江等[25]发现海洋真菌菌株M-401代谢物对藤黄八叠球菌具有较强的拮抗作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、弗氏志贺氏菌和黑曲霉也有不同程度的拮抗作用。2008年谭倪等[26]从南海红树林内源真菌Fusarium sp. #ZZF51分离得到一金属铜络合物,该络合物对多种细菌和癌细胞均有抑制活性。邵长伦等[27]从红树林分离出一株内生真菌B77。首次从海洋真菌中分离得到的化合物3-O-methyl-fusarubin和Fusarubin,体外实验表明化合物对金黄色葡萄球菌具有较好抑制活性。我国已把开发海洋生物资源列入国家自然科学基金和863计划项目。还有沿海省区和有关机构及高等院校也投入相当的资金。本实验室从厦门海域采样,筛选具有抗菌活性的海洋微生物,分离到一株具有抗菌活性的海洋小链霉菌。
2 海洋微生物活性产物研究意义
目前已发现的抗生素有三分之二来自于放线菌[28],因此在海洋放线菌中寻找新型抗菌活性物质成为目前研究的热点[29, 30]。海洋的特殊环境如高压、高盐、低温、贫营养或无光照等,这些造就了海洋微生物菌群的特异性,使其能够产生不同于陆生微生物的活性物质。在近年的研究中,已有近万种新的海洋天然产物被发现,这些海洋天然产物具有抗菌、抗氧化、细胞毒活性、免疫调节等作用,已成为当今世界新药研发的热点。有的药物已进入临床实验阶段或已进入临床,并取得了丰硕的成果[31]。各国学者正加紧从海洋微生物中分离具有抗菌抗肿瘤等的活性物质,近年国内海洋微生物代谢产物研究取得了长足进步。国内发现新颖结构和新活性化合物的研究报道也明显增多[32, 33, 34]。21世纪,海洋必将成为寻找新药的重要药库。
3 海洋微生物活性产物的研究方法与产业化难题
3. 1 海洋微生物活性物质分离筛选方法
3. 1. 1 高通量筛选法
从不同海域采集的大量生物和非生物样品,必须经过分离才能得到各种微生物菌株,对这些微生物菌株需要进行大量的活性筛选以得到产生次生代谢产物的活性菌株。这需要耗费大量的时间和精力才有可能得到有价值的菌株,因此需要建立一套行之有效的快速分离筛选方法,目前常用快速有效的自动化高通量药物筛选方法(HTS)或快速分子筛选方法进行筛选。高通量筛选是目前药物筛选的主流技术,它是以多孔板为载体,用高密度、微量自动化加样的方法,快速和平行地测试标靶对化合物的结合能力或生物学活性,将高通量筛选技术运用于放线菌次生代谢产物的筛选,可极大地提高筛选效率,加速发现新先导化合物的进程,所以可利用HTS技术研究先导化合物和衍生物的转运、代谢、毒性和作用机理,很快确定治疗药物的候选物,提高药物研制和开发的效益[37, 38]。HTS常用筛选模型有抗氧化模型[39]、乙酰胆碱脂酶(AchE)抑制剂模型[40]、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂实验模型[41]、晚期糖基化终产物(AGEs)模型等。
3. 1. 2 宏基因组筛选新活性物质[42, 43]
由Davies等所创导的宏基因组工程技术[44],为Handelsman等[45]系统归纳后,提出了宏基因组(metagenome)的概念,泛指某一自然环境中全部微生物的基因组群。其研究策略克服了绝大多数环境微生物难以通过一般实验室分离培养的现实。宏基因组药物研究平台,是将海洋某个小的生态系统中的全部基因组,通过基因工程的方法克隆到可培养的宿主细胞中,建立宏基因组文库。文库中包含该小生态系统中微生物(可培养的和非可培养的微生物)全部基因,从而在该文库中筛选活性物质以及相关基因,克服了微生物培养的难题,扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新的生物活性物质的机会[46]。
3. 1. 3 其他筛选方法
随着研究的深入,不断出现新的筛选方法。定向筛选可以筛选到高度选择性的低毒性的抗生素,克服病原菌的耐药性。杨隽等人以脂磷壁酸为靶点的新抗筛选模型筛选与糖肽类抗生素无交叉耐药性的新抗生素[47],依此模型,从1200株放线菌中筛选出2株阳性菌株。还有以几丁质酶为靶标筛选其抑制剂来筛选抗真菌药物,以支原体模型来筛选作用于细菌细胞壁的抗生素。而化学筛选[48]是基于这样的一个假说:新结构的化合物必然有令人感兴趣的生物活性。对大量化合物通过簿层色谱建立数据库,然后对未知的化合物的薄层色谱(TLC)输入数据库予以分析。
3. 2 海洋微生物天然活性物质走向产业化的难题[49]
一种新化合物的发现需要付出大量的前期工作积累,而一种新化合物要从实验室,走向产业化更需要付出几年甚至几十年的不懈努力。仅临床前研究,实验室研究阶段就面临着活性新化合物的各种海洋微生物不易培养和有效成分含量偏低,活性成分不易萃取、分离、纯化等一系列的难题。根据相关报道,目前可培养的海洋微生物仅占全部海洋微生物的1%,这些可培养的海洋微生物又面临着菌种退化,基因突变等一系列难题。在人工培养条件下,生物的生长环境与海洋原生态环境差异巨大,经过若干代继代培养或长时间菌种保存,某些活性菌株可能不再产生的活性化合物。海洋微生物次生代谢产物的含量偏低,这将不利于今后工业化生产。再者,微生物发酵产物成分相当复杂,如何从复杂体系中高效大批量的萃取、分离、纯化目标活性化合物也是目前面临的难题。这些都直接影响到新的活性化合物的应用前景和工业化道路。目前,可采用一系列生物技术和化学合成方法如基因工程、发酵工程、有机合成等来解决新药研发过程临床前研究中所面临的问题,从而缩短从实验室到产业化的过程。
4 海洋微生物活性产物的开发和应用展望
随着经济社会的发展和科学技术的进步,人类在医学方面的研究已经深入到分子领域,然而新的感染性疾病的发生及耐药菌株的大量的出现,成为严重威胁人类健康的杀手。人类目前的最后一道应对严重感染性疾病的抗生素——万古霉素也受到了耐药菌株的挑战。面临此种境地,人类不得不寻求新的抗生素以应对不断产生的耐药菌株。然而,传统抗生素来源——陆地土壤中的放线菌,已经被人类利用殆尽。人类不得不寻找新的药物来源, 20世纪60年代来自海洋的新发现,打开了寻找新的活性化合物的大门,人们将目光着眼于广袤的海洋,“下海”成为各国学者热衷的研究议题。虽然最近几十年从海洋中发现了很多天然活性物质,然而这仅仅是冰山一角。海洋中存在着令人难以估量的生物资源和药用资源。据统计,目前可被培养的海洋微生物仅占全部海洋微生物总数的1%,绝大多数的海洋微生物仍然不被人们所了解。他们是否产生新的活性物质?是否产生的次生代谢产物对人类疾病特别是目前医学难题的疾病存在着特效?带着这些疑问和美好憧憬,各国的研究人员加紧研究、开发和利用海洋微生物资源,以期获得对人类进步和健康事业具有深远影响的新化合物。令人欣慰的是各国政府对海洋微生物资源的研究和开发经费支持正在逐年增加,全球医药巨头也投入巨资加快新化合物的发现和新药的研发。海洋的独特生态环境造就了许多结构新颖的天然产物并包含了新的活性功能。未来,研究的方向将趋向于对目前不可培养的微生物领域;人工条件下模拟海洋原生态环境;活性产物的大通量筛选模型的建立和全天候自动化的筛选等领域。形成多学科相互渗透,联合攻关,并促进产学研一体化,使得海洋微生物天然产物的开发、应用进入新天地。
参考文献(略)
采编:guoq
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