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叶绿体基因工程研究进展
日期:2012-08-28 作者:崔柳青 李一帆 潘卫东 来源:《生物技术通报》.-2012,(6).-1-5 点击:
 
    叶绿体是普遍存在于陆地植物、藻类和部分原生生物中执行光合作用功能的半自主性细胞器,含有自身的DNA和蛋白质合成体系。叶绿体基因工程与核转化相比具有明显的优点:基因拷贝数多,便于目的蛋白的大量生产;遗传性状稳定,不会通过花粉传播污染环境,生物安全性高;可进行外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默等。自Boynton和Svab分别在1988年和1990年完成了莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和烟草(Mcottana tabacum)叶绿体的遗传转化以来,叶绿体基因工程发展迅速,并被成功应用到更多的植物种类。文章简述了叶绿体基因工程的概况及其实际应用,分析了存在的问题,并对其前景进行展望。
1 叶绿体基因工程概况
1.1 叶绿体基因组的特征
    叶绿体是植物细胞和真核藻类的质体细胞器之一,是光合作用的场所。在叶绿体中的重要活动包括氧的产生,碳的固定,淀粉粒的生成,氨基酸、脂肪酸和色素的合成,硫和氮代谢等主要方面。单个植物细胞中的叶绿体基因组中有1000-10000个基因拷贝,并且在大多数被子植物中是母系遗传。大部分叶绿体DNA为共价闭合的双链环状分子,少数是线状。叶绿体通常被认为是蓝细菌的衍生物,在真核细胞进化过程中被捕获,与真核细胞基因组相比,叶绿体基因组大小减少较多,一般在115-165kb范围内,但基因组序列仍然呈现清晰的相似性。
1.2 叶绿体转化系统的优势
1.2.1 高效表达外源蛋白 外源基因在叶绿体基因组中稳定整合之后,能够使外源蛋白大量积累,这是因为在每一个植物细胞中质体遗传系统的多倍体特性可以使叶绿体基因组的基因拷贝数目多达1000-10000,保证了功能基因拷贝数维持在较高数量。此外,叶绿体转化体系消除了核转化体系中频繁出现的位置效应,因叶绿体转化载体两侧的同源序列保证了外源基因在和叶绿体基因组进行同源重组时的位点特异性,这就为外源基因的高效表达提供了有利条件。叶绿体转基因植物还具有其他一些优点,如不会出现转基因沉默现象。这使得转录本的积累比核转化植物可以高169倍,并且外源蛋白的表达量在成熟叶片中可占可溶性蛋白的45.3%,在老叶片中占可溶性蛋白的46.1%。
1.2.2 安全性好 在大多数被子植物中,叶绿体基因都是母系遗传的,所以这些叶绿体中的转基因不会通过花粉进行传播,使叶绿体转化成为创造和培养基因修饰的转基因檀物的一个有价值的工具,并且产生更低的环境危害。因此,利用这种生物防范策略也可以使传统的和修饰的转基因作物共存,雄性不育遗传工程技术正是这种转基因防范策略的进一步体现。此外,植物来源的医疗蛋白不受人类病原体和哺乳动物病毒载体的危害。因此,叶绿体系统为传统的生产系统,如微生物发酵或哺乳动物细胞培养等提供了一个可行的替代选择。
1.2.3 后代不易分离 母系遗传是叶绿体的遗传特性,因此在得到纯合并且稳定的叶绿体转化植株后,这样纯系的后代不会因有性杂交而分离,从而一直保持纯系。
    除上述优点,叶绿体遗传工程还具有转基因累加的独特优势。例如,可以同时表达多个基因以实现通过一次转化就能生产多价疫苗。一些异源操纵子已经在转基因叶绿体中表达,多顺反子也没有先被加工成单顺反子就被成功翻译。此外,在叶绿体中合成的外源蛋白经适当的转录后修饰被正确折叠,包括生成二硫键、脂质修饰等。
1.3 叶绿体转化技术与过程
    当今最为常用且稳定的叶绿体转化方法主要有两种,即基因枪法。和聚乙二醇法(PEG法)。基因枪法程序简单,外源基因表达水平高;聚乙二醇介导的转化方法多应用于早期和最近的研究中。由于在莱茵衣藻中通过电子轰击方法实现了叶绿体转化的第一次成功,这个方法也因其高转化率和简单的操作成为叶绿体转化的一个有效途径。
    叶绿体转化过程一般分以下4步进行:(1)将外源DNA通过适当的转化方法导入叶绿体中;(2)将外源DNA整合到基因组中;(3)筛选成功转化的叶绿体的细胞;(4)稳定叶绿体转化株的繁殖。
1.3.1 选择标记基因 由于叶绿体DNA有多个拷贝,选择适当的标记基因对实现转化过程中所有基因拷贝的同质化较重要,因为这个富集过程涉及到在选择性培养基上逐轮淘汰非转化的叶绿体。第一个用于叶绿体转化的选择标记基因是质体16SrRNA基因(rrnl6),转化株由壮观霉素抗性筛选而且效率很低。随后,编码氨基葡糖苷3′-腺苷酰转移酶的aadA基因被用作选择标记基因,用aadA基因转化显著提高了叶绿体转化子的回收率,使被轰击的每个叶片样品中平均存在一个转化子。NptⅡ基因也被用于烟草叶绿体转化的标记基因,但是转化效率也低,大约每25个被轰击的样品中存在一个转化子。高效表达的neo基因使质体转化效率得到明显改善,用携带neo基因的载体(pAAK201)轰击的25片叶子中产生了34个卡那霉素抗性的克隆。编码草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)的bar基因也曾经被用作标记基因,但其仍然不足以得到广泛的应用。另一个标记基因是提供甜菜醛抗性的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因,携带甜菜碱醛选择性的叶绿体转化效率比烟草中携带壮观霉素的高25倍,表达甜菜碱醛脱氢酶基因的转基因胡萝卜植株能够在浓度高达400 mmol/L的NaCl环境中生长。但除此以外并未见以甜菜醛抗性作为筛选标记的报道。此外,绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LuxAB)等既可作为标记基因又能作为报告基因,尤其是LuxAB基因的应用更加广泛。Franklin 和Mayfield等在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了GFP和LuxCt,其中LuxCt是以荧光素酶基因LuxAB为基础进行适当改造而成,它在莱茵衣藻叶绿体中的表达使得转化阳性克隆能够被直接观察,便于筛选。
1.3.2 插入位点 叶绿体表达载体具有宿主基因组1-2kh大小的左侧和右侧的侧翼序列,用于通过同源重组将外源基因插入到叶绿体DNA中。在叶绿体基因组中的插入位点是由所选择的位于标记基因和目的基因两侧的叶绿体DNA片段决定的。已经在叶绿体基因组多个位点完成了外源DNA片段与叶绿体基因组的整合,最常用的3个插入位点是trnV-3′rDs12,tmI-trnA和trnfM-trnG。tmV-3′rps12和tmItrnA位点都位于叶绿体DNA中25 kb的反向重复序列区域,而插入这些位点的基因能够在反向重复序列区域被快速复制成两个拷贝。trnfM-trnG位点位于叶绿体DNA的大单拷贝区(LSC)内,插入trnfM和trnG之间的目的基因在每个叶绿体DNA中只有单一拷贝。
1.3.3 调控序列 叶绿体的基因表达水平主要是由启动子和5′端非翻译区元件决定的,因此,包含有一个核糖体结合位点的合适的5′非翻译区是叶绿体表达载体的重要组成。为了通过转基因表达使蛋白大量积累,首先需要一个强启动子来保证高水平的mRNA,大多数实验室用了叶绿体rRNA(Prrn)操纵子的强启动子。转基因mRNA的稳定性是由转基因两侧的5′-UTR和3′-UTR序列保证的,转基因蛋白的积累依赖于插入到编码目的基因的开放阅读框上游的5′-UTR序列。由同一肩动子(Prrn)调控引起的蛋白积累的差别可能高达千倍,这是由于对翻译调控信号的选择不同。最常用的5′-UTR和3′-UTR是psbA/TpsbA,Mayfield等对atpA 5′-UTR、rbcL 5′-UTR、psbA 5′-UTR与atpA 3′-UTR、rbcL 3′-UTR、psbA 3′-UTR进行了不同组合的研究,证实不同的组合可能会引起转录和翻译效率的不同,并利用atpA 5′UTR-luxCt-rbcL3′UTR调控组合在莱茵衣藻叶绿体中成功高效表达了既有报告基因功能又具有定量功能的荧光素酶基因。
1.3.4 宿主植物种类 烟草叶绿体是被最广泛开发利用的叶绿体转化系统,这依赖于对其遗传转化操作的简便性。一棵烟草植株能够产生近百万颗种子,一公顷的烟草每年能够产生多于100t的叶子。在开花之前收获叶子,除了能获得母系遗传保护的基因以外,还能够获得几乎全部的转基因。有研究指出烟草中“转基因逃逸率”为0.0087%-0.00024%,这使其称为叶绿体生物反应器的一个理想系统。在作为生物反应器表达外源基因方面,烟草要比最常用的大肠杆菌发酵系统的花费低50倍。叶绿体转化技术扩展应用到其他植物种类中对于开发叶绿体生物反应器平台较重要,虽然最初只在陆生植物烟草和海洋藻类中的衣藻中得到应用,但是现在叶绿体转化已被更广泛应用于其他植物种类,包括重要的经济作物如大豆、棉花、芸苔、土豆、番茄、莴苣、甜菜及茄子等。
2 叶绿体基因工程的应用
2.1 提高光合效率
    对于植物来说,它的光合效率是有限的,只能把小部分太阳能转化为植物所需要的能量。Rubisco酶是植物光合作用的关键酶之一,它既可以产生可溶性蛋白,同时又对CO2的固定起着限制作用。提高光合速率可以通过两种途径提高,一种方式是改善酶的特性,降低其催化植物代谢进入光呼吸途径,减少光呼吸对能量的浪费;另一种则是使酶催化的循环过程加速。许多研究者正在试图通过改善Rubisco酶特性来将植物的光合作用效率提高,最近在水稻的定点整合试验中取得了成功,这有力地证明了叶绿体基因工程是能够提高植物光合作用效率的有效方法。
2.2 改良作物特性
    一些环境压力如疾病、干旱、害虫、盐度和冰冻等会严重限制植物生长和发育。为了改良植物特性,许多研究者进行了一系列的尝试,多种重要的作物特性通过叶绿体基因组转化被设计改良,如除草剂抗性、昆虫抗性、耐盐性和耐旱性。
    在烟草中已有利用叶绿体基因工程培育具有草甘膦抗性的烟草植株以控制杂草的相关研究。bar基因编码使除草剂失活的草胺膦乙酰转移酶,通过叶绿体基因工程可以使bar基因高效表达并使草胺膦乙酰转移酶的积累量达到一定水平(总蛋白的7%,从而使田间作物具有除草剂抗性。
    在叶绿体基因组中高水平的表达昆虫抗药性基因也已有相关研究。cry基因尤其能够在叶绿体基因组中被很好的表达而不需要改变密码子的使用,也不需要其他序列的操控。因此,这些转cry基因植物的叶子对食草性昆虫的幼虫具有很大的毒性。但最近有报道称叶绿体基因组中cry基因过高水平的表达会导致植物生长受到严重阻滞,说明适当的表达水平而不是最大化的表达是获得具有良好昆虫保护性作物并降低减产所必需的。
    表达甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的叶绿体转基因植株能够在高浓度NaCl(高达400mmol/L)条件下生长,这是迄今为止在转基因作物中所报道的最高水平的耐盐性能。在一些胁迫条件下,如冰冻、高温、盐或干旱,细胞中会积累海藻糖,因此它在保护细胞免受这些胁迫伤害中起着重要作用。在核转化的植物中即使海藻糖合成酶基因的表达处于较低水平,植株也会表现出多效性效应。与此形成对比,叶绿体转海藻糖合成酶基因植株能够正常生长并且积累的海藻糖是核转化植株的25倍,叶绿体转基因植物表现出很高程度的耐旱性,在6%的聚乙二醇条件下仍然能够保持绿色和健康,而野生型植株则完全褪色。△9脱氢酶基因是脂质代谢中的重要基因,利用叶绿体转化技术已将该基因成功转化到烟草中,证实了利用质体转化技术在营养和再生组织中改良脂质成分来提高抗寒性的可行性。
2.3 生产药物
    到目前为止,已有超过100个基因在叶绿体基因组中稳定整合并表达,包括基因编码的有工业价值的酶、生物材料、生物制药蛋白、抗体、抗生素、疫苗抗原和具有重要农学特性的基因等。通过恰当的基因构建使蛋白在叶绿体中获得高水平的积累,证明了叶绿体基因工程技术强大的潜力。2001年,人血清蛋白(HSA)在转基因叶绿体中得到高效表达,说明在转基因叶绿体中表达药物蛋白已经成为可能;霍乱毒素亚基(CTB)基因在转基因叶绿体中高度积累而对细胞没有毒害,证明叶绿体转化在实用型疫苗生产中的可行性。最近,烟草叶绿体转化系统作为HIV-1 p24抗原的一个生产平台的可行性已被测试。
    如上所述,转基因叶绿体已经用于多种治疗蛋白的生产,表明叶绿体应该具有能够使蛋白正确折叠和形成二硫键以表达出功能完全蛋白的机制。尽管利用叶绿体发展植物分子农业医药有了快速的进步,但是糖蛋白还没有能够在转基因叶绿体中表达,因为N-或O-糖基化是保证许多蛋白质稳定性和功能性所必需的。如果糖蛋白能够被表达,并且表达的蛋白有正常的糖基化位点和功能,叶绿体基因工程就能应用于更多方面,而这都需要对叶绿体中糖蛋白表达和糖基化机制进行进一步的研究。
2.4 改造植物代谢途径
    叶绿体基因工程是代替传统的核转基因表达体系并应用于新陈代谢工程的一种方法,这主要是因为叶绿体基因工程可以使转基因容量大大增加,而且能够通过连接多个目的基因到操纵子上达到一系列转基因的累积效应。叶绿体具有许多代谢途径,因此它通常被称为“植物细胞的生物合成中心”。鉴于光合作用的重要性和它的许多成分都是由叶绿体编码的,其成为代谢工程中一个较显著的备用途径。
    迄今为止,引入到叶绿体基因组中的最复杂的代谢途径是生物塑料聚羟基丁醛(PHB)的合成。将PHB生物合成的3种酶基因共同转入到烟草叶绿体基因组中,PHB在叶绿体中大量的积累引起了雄性不育和严重的生长迟缓。最近有研究提示,3种酶中的β-ketothiolase的表达是叶绿体转基因植物雄性不育的原因。通过将操纵子置于核编码的乙醇诱导的T7 RNA聚合酶的控制下,形成了改良的诱导型PHB生产系统,该系统可以靶向叶绿体并控制叶绿体基因组中的phb操纵子。
    目前,叶绿体转化应用于代谢途径改造还局限在模式生物烟草中。为了研究代谢工程在非绿色质体中的可能性,有研究者在番茄中进行质体转化来改变类胡萝卜素的生物合成以生产含有更高维生素A的水果。这个研究证明了在非绿色植物器官中通过质体转化进行代谢工程的可行性,这也是质体转化技术应用于食用作物重要的一步。
3 存在问题
3.1 叶绿体的同质化问题
    植物叶绿体转化不同于细胞核转化的重要一点是同质化问题。高等植物的每个细胞中含有许多叶绿体,单独的每个叶绿体又含有许多叶绿体基因组拷贝,所以转化后所得到的叶绿体植株中未被转化的野生型叶绿体和被转化的叶绿体同时存在,一般情况下是异质的,这在遗传学上较不稳定。因此,在将外源基因导入之前必须使转基因植株易于同质化,然而改造叶绿体的基因组相当困难,它的基因组结构使人们难以进行深入的加工和修饰。
3.2 选择标记基因
    应用不同的选择标记基因,转化效率不同。如aadA基因转化能大大提高叶绿体转化子的回收率。可见,有效的选择标记基因是提高叶绿体转化效率的关键因素。并且,为非绿色质体选择合适的标记基因是在重要作物中构建质体转化系统的一个可行的途径。这个领域的快速发展需要对叶绿体基因工程进一步的研究应用。
3.3 植物种类有待扩展
    叶绿体基因工程只在少数的几种植物中获得成功,主要原因是大多数植物的叶绿体基因组序列还没有完全测出,无法确定同源重组和插入位点。截至目前,叶绿体转化技术已经在多种高等植物中得到成功尝试,而稳定的转化系统仅仅在烟草中得以构建,番茄、油菜、大豆、胡萝卜及莴苣等叶绿体转化体系相继建立但仍处于开发阶段。尽管在这个领域已经取得了重要的进步,但是仍然存在许多挑战,单子叶植物包括水稻、玉米和高粱等作物的叶绿体稳定转化还没有取得成功,需要进一步的尝试和研究。
4 展望
    迄今为止,在烟草叶绿体基因组中稳定整合并表达的转基因已超过40余种,而且产生了有价值的工业生物材料和治疗蛋白。重组蛋白在叶绿体工程系统中的高效表达表明植物作为生物反应器的潜在巨大效益,并且这种环保的植物生物反应器途径已逐渐被应用于治疗蛋白、疫苗和生物材料的生产。
     叶绿体基因工程作为分子水平上的一种技术手段,为转基因植物的研究开辟了一个新的方向,为外源基因在高等植物中表达提供了一个良好的平台。然而这只是第一步,这个技术尚不能使产品商业化,目的基因表达水平的调控还有待解决,并且叶绿体转基因植物需要得到更多层面的评估。随着对叶绿体基因工程的进一步探索与完善,叶绿体作为一种新型高效的生物反系统必将为生物工程领域带来新的希望。
    作者单位:(1.河南工业大学生物工程学院,郑州 450001;2.郑州大学生物工程学院细胞生物学研究室,郑州 450001)
    文章采集:caisy
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