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植物病原菌抗药性研究进展
日期:2012-12-24 作者:郑肖兰 傅 帅 郑服丛 李 锐 吴伟怀 贺春萍 来源:热带农业科学 点击:
 
植物病原菌对杀菌剂产生抗药性是植物病害化学防治中面临的主要问题之一, 简称植物病原菌抗药性或杀菌剂抗药性, 是指病原菌长期在单一药剂选择作用下, 通过遗传、 变异, 对此获得的适应性。 联合国粮农组织(FAO)对杀菌剂抗药性推荐的定义是 “遗传学为基础的灵敏度降低”。 特别是随着高效、 内吸、 选择性强的杀菌剂被开发和广泛应用, 杀菌剂抗性越来越严重和普遍, 成为制约化学防治措施发展的关键因素之一。
20 世纪 50 年代中期, 美国 James.G..Horsfal首次提出病原菌对杀菌剂敏感性下降的问题。 随着植物病原菌抗药性问题在多种杀菌剂上呈现出来,许多国家和地区相继开展了杀菌剂的抗性研究, 国外关于植物病原菌对杀菌剂抗性机制研究部分已达分子水平, 我国关于植物病原菌对杀菌剂抗药性的研究主要处于监测水平, 而对抗性利用方面的研究还较少。 本文总结了近年来对植物病原菌杀菌剂的研究进展, 为杀菌剂的开发和抗性治理提供参考。
1 抗药性植物病原菌生物学特性
抗药性菌株的生物学特性即抗性菌株的越冬、越夏、 生长、 繁殖和致病力等方面的特性, 研究上主要以适合度来评价抗药性菌株的生物学性状改变情况, 适合度是指病菌抗药性突变体与敏感群体在自然环境条件的生存竞争能力。 即是在生长、 繁殖速率、 致病性等方面, 是否变化及变化程度, 其强弱关系到抗药性菌株是否容易形成抗药性群体。除少数杀菌剂外, 病菌对多数药剂产生抗性后均表现不同程度的适合度下降。 张弛等对抗氟硅唑的叶霉菌抗性菌株的菌丝生长速率、 菌丝鲜重、 渗透敏感性、 抗药性突变体遗传稳定性共 4 项指标的测定显示番茄叶霉病菌的生物学特性与其对氟硅哇的敏感无直线相关性[1]。 低抗和中抗突变体与敏感菌株相比较能够正常生长, 但当菌株产生高抗药性时生长能力显著下降[1]。 陈明丽等对稻瘟病菌抗烯肟菌酯的抗药性菌株的生长速率、 产孢能力研究证明, 抗药性菌株适合度显著低于敏感性菌株, 活体试验表明, 抗药性突变体的致病力较差, 与敏感性菌株相比差异显著[2]。 孙芹报道在紫外线诱导、 药剂驯化条件下诱导产生的两株抗烯肟菌胺黄瓜白粉病菌株和敏感菌株分别接种黄瓜叶片发现获得的抗性菌株致病力低于敏感菌株的致病力。 再根据 Tooley 等介绍的一种测定适合度指数的方法, 测定发现驯化获得的抗性菌株的适合度指数明显低于敏感菌株[3]。 主要表现在其致病力减弱、 产孢能力的减弱上。也有一些菌株适合度较高, 与野生敏感菌没有差异甚至高于敏感菌株。 周明国研究证明禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性菌株的生长、 繁殖和致病力等性状与野生菌株几乎没有变化, 说明抗药性病原群体与敏感性病原群体有较高的生存竞争能力或适合度[4]。通过抗药性菌株与敏感性菌株混合接种、 不同选择压力下自然界抗药性病原群体比例、 以及抗药性病害循环不同阶段抗药性群体比例的变化态势等研究也证实了这一点。 王文桥发现了在药剂驯化条件下, 产生对恶霜灵抗性的突变马铃薯晚疫病菌和葡萄霜霉病菌株适合度好于原菌株, 竞争力较强, 稳定性较好[5]。
2 病原菌抗药性机制
研究植物病原菌对杀菌剂产生抗药性的原因和抗性机制对有效防止或延缓对杀菌剂抗药性的产生具有重要意义, 不仅可以加深对杀菌剂抗药性的认识, 还为正确提出和实施治理对策提供理论依据。
2. 1 植物病原菌抗药性的遗传机制
植物病原菌的抗药性有两种, 即核基因(nucleargene)控制的抗药性和胞质基因(cytoplasmic gene)控制的抗药性, 分别是由染色体基因或胞质遗传基因的突变产生。 其中核基因控制的抗药性多发生在病原真菌上, 而胞质基因控制的抗药性在病原细菌上较为常见。 对于核基因控制的抗药性, 又可以分为 主 效 基 因 (major-gene) 抗 药 性 和 微 效 多 基 因(poly-gene)抗药性。
2. 1. 1 主效基因控制的抗药性
由主效基因控制的抗药性, 田间病原群体或敏感性不同的菌株杂交后代对药剂的敏感性都呈明显的不连续性分布, 表现为质量性状, 很容易识别出抗药性群体。 使病原物表现质量遗传抗性反应的杀菌剂有苯并咪唑类、 苯酰胺类、 羧酰替苯胺类、 二甲酰亚胺类及有关含铜化合物。主效基因抗药性根据控制抗药性主效基因的多少还可分为多基因(multi-gene)抗药性和单基因(single-gene)抗药性。 在多基因抗性中, 其中的任何一个主效基因的突变都会使病菌产生抗性, 如在粗糙链孢霉(Neurospora crassa)中有 6 个主效基因控制对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性, 其中任何一个基因发生突变都可产生抗性[6,7]。 但当有两个或两个以上的主效基因同时发生突变时, 存在两种情况,一是某一主效基因会对其他主效基因具有上位显性作用, 即抗性水平与该主效基因单独突变时一致;另一种情况是主效基因间会发生互作, 从而使得抗性水平不同于单一主效基因发生突变, 如 Molnar 研究证明在尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)对苯菌灵的高水平抗性就是由 2 个主效基因的互作引起的。但如果两个主效基因中有一个是上位基因的话,那么这两个基因的作用只相当于一个基因的作用[8]。而 Faretra 在 1992 年 研 究 灰 葡 萄 孢 霉 (Botrytiscinerea)对苯并咪唑类药剂的抗性中报道, 单基因抗性的基因座位上不同的碱基位点可以分别发生突变或同一碱基位点可以发生不同的突变, 并能使病菌表现出不同的抗性水平, 即存在一种复等位基因抗性(multiple allelic resistance)的情况, 即该基因座位(locus)上不同的碱基位点(sites)可以分别发生突变或同一碱基位点可以发生不同的突变, 并能使病菌表现出不同的抗性水平, 如灰霉病菌(Botrytiscinerea)、 苹果黑星病菌 (Venturia inaequalis) 等对苯并咪唑类杀菌剂的抗性。 这与袁善奎研究玉蜀黍赤霉(Gibberlla zeae)对多菌灵的田间抗药菌株的抗性遗传方式一致, 都属于单基因抗药性[9,10]。 但无论在什么情况下, 只要是主效基因控制的植物病原菌抗药性, 田间病原群体或敏感性不同的菌株杂交后代对药剂的敏感性都呈明显的不连续性分布, 很容易识别出抗药群体。
2. 1. 2 微效多基因控制的抗药性
微效多基因抗药性由多个微效基因控制, 区别于主效基因所控制的抗药性的基本特征是田间病原群体或敏感性不同的菌株的杂交后代对药剂的敏感性呈连续性分布, 表现数量性状。 即这些基因间具积加效应, 单个或少数基因的突变引起的抗性水平是微不足道的。 此类抗性病菌对药剂高水平抗性的敏感性下降, 但很少表现完全失效, 增加用药量或缩短用药周期可提高防效。 使病原物表现数量遗传抗药性反应的杀菌剂有多果定、 甾醇脱甲基抑制剂、放线菌酮、 吗啉类和哌啶类及乙菌啶等。 Polach 根据田间群体对药剂的敏感性呈连续性分布以及遗传学的研究, 认为 Venturia inaequalis 对多果定的抗性是由微效多基因控制的[11]。 在 Nectria haematococcavar. cucurbitae 和 Nectria haematococca var. pisi 中 ,Demarkopoulou 及 De Falandre 分别研究其诱导的丁苯吗啉的抗药突变体都有 3 个与抗性有关的基因, 而且具有积加效应, 因此认为对该药剂的抗药性是微效多基因抗药性[12,13]。
2. 1. 3 胞质基因控制的抗药性
真菌对少数药剂和细菌对大多数药剂的抗药基因属于胞质基因控制的抗药性, 这些抗药基因主要位于真菌的线粒体和细菌的质粒中。 Chang 等对寄生疫霉(Phytophthora parasitica)的研究表明, 链霉素抗性也是由胞质遗传因子决定的, 属母性遗传[14]。 王源超等报道了恶疫霉突变株对甲霜灵的抗性在游动孢子后代持续发生分离的现象, 认为这种抗性性状可能由细胞质因子控制[15]。 而早在 1971 年就发现了病原真菌对作用于菌体细胞色素 bc1 复合物的 QoIs 类药剂的抗药性也是由线粒体基因控制的[16]。 使病原物表现胞质基因控制的抗药性反应的化合物有铜制剂(copper)、 链霉素(streptomycin)、QoIs 类药剂(Qo respiration inhibitors)等。
2. 2 植物病原菌抗药性的生理生化机制
2. 2. 1 改变细胞壁细胞膜的通透性, 减少摄入量或增加排泄
病原物细胞常通过某些代谢变化使细胞膜通透性变化而阻碍足够量的药剂通过细胞膜或细胞壁而到达作用靶点, 使其无法发挥其杀菌作用来产生自我保护。 如多氧霉素类是抑制菌体几丁质合成酶的生物活性, 破坏细胞壁的生成的一类杀菌物质, 而抗药性菌体的细胞壁结构发生变化, 使抗菌素难以进入菌体到达作用部位而产生抗药性[17]。有些病原菌避免其自身中毒的方式是在杀菌剂大量进入体内后迅速地将杀菌剂排出体外, 阻止药剂积累而表现抗药性。 周明国研究了脉孢霉对三唑醇的抗药分子机制, 结果表明突变体增加了对药剂的排泄作用, 降低了药剂在体细胞内的积累, 致使在相同的药剂剂量处理下, 麦角甾醇生物合成过程受阻影响降低[18]。Waard 等在含药培养基上获得了Aspergillus nidulans.对氯苯嘧啶醇的抗性菌株, 与敏感菌株相比抗性菌株体内药剂耗能外流是在药剂流入一开始就进行, 使菌株体内氯苯嘧啶醇的积累要比敏感的菌株体内积累少得多[2]。
2. 2. 2 影响杀菌化合物毒性
抗药菌株可通过某些变异影响生化代谢过程,在药剂到达作用位点之前就与细胞内其它生化成分结合而降低杀菌剂转毒能力、 钝化乃至去除毒性,将有毒的农药转化成无毒化合物。 例瓜枝孢菌通过降低6-氮杂尿苷嘧啶转化成6-氮杂尿苷-5-磷酸的能力来提高其抗药性的。 Miyagi和Uesugi等研究表明, 田间中抗异稻瘟净菌株对异稻瘟净降解速率高, 降解产物毒性低[19,20]。 祝明亮等研究认为室内获得的稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)高抗突变体对硫代磷酸醋类杀菌剂的抗药性的抗药机制是裂解有机磷类药剂 “s-c” 键以致使其失去生物活性[21]。
2. 2. 3 降低亲和性或形成保护性代谢途径
病原菌可通过改变杀菌剂作用位点的结构, 使杀菌剂与其作用位点的亲和能力降低, 或改变其代谢途径, 使杀菌剂无法在作用位点发挥作用, 从而降低了杀菌剂的杀菌能力。研究发现病原菌β-微管蛋白发生变化, 导致苯并咪唑类杀菌剂与病原菌亲和性下降是病原菌产生抗药性的主要原因。 Butters 在研究病菌对苯并咪唑类药剂的抗性分子机制的研究发现, 田间抗药性菌株大都主要涉及 198 和 200 位置氨基酸的改变[22]。常用的杀菌剂如苯并咪唑类、 苯酞胺类、 羧酞替苯胺类杀菌剂及春雷霉素等抗菌素等, 真菌产生抗药性就是分别在相应的作用靶点β-微管蛋白、 mRNA聚合酶、 琥珀酸-辅酶Q还原酶复合体和核糖体组成发生构象改变, 降低了药剂与这些靶点的亲和性而表现抗药性的。形成 “保护性” 的代谢途径即改变某一段的代谢途径, 使其不通过作用点。 例如抗霉素 A 是作用于呼吸链中的细胞色素 b 和 c 间的电子传递。 但是具抗性的玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)孢子的电子传递通道发生突变, 使电子传递绕道而行, 以致产生抗药性。
3 抗药性治理技术
抗药性研究的主要目的是制定抗药性治理策略, 治理策略可从以下几个方面着手:(1)靶标对常用药剂的敏感性基线是研究抗药性发展和治理效果的重要参数, 所以首先要建立各种病原菌对杀菌剂的敏感性基线。 尤其是对刚刚进入我国市场的杀菌剂应尽快建立各种重要病原菌的敏感性基线。 通过敏感性基线有利于了解抗药性的发生发展态势, 及时制定有效的抗药性治理策略,还有利于评价抗药性治理策略的有效性。(2)加强药剂的抗性风险监测风险评估, 建立各病原菌和杀菌剂的抗性风险级别。 随着分子生物学技术的突飞猛进, 采用分子生物学方法进行抗药性检测可以快速、 准确地检测到抗性频率很低(小于1/10 000)的突变群体, 从而弥补了传统检测方法的不足[23], 但分子检测方法的应用前提是需要了解病原菌对杀菌剂抗药性突变位点, 所以要与传统检测方法相配合使用以达到最佳效果[24]。 通过建立各病原菌和杀菌剂的抗性风险级别来决定合理的用药方法, 风险系数高的, 连续使用次数应当减少, 并与风险系数低的杀菌剂轮换使用, 从而有效地预防和延缓抗药性的出现。(3)研究开发并推广应用具有多作用位点、 低抗性风险、 无交互抗性的新药剂。 杀菌剂复配或交替使用, 限制用药以减轻具有抗药风险杀菌剂对自然抗药菌株的选择压力, 延缓或克服抗药性的发生发展。 此外研制开发具有增效作用的杀菌剂混剂,采用不同作用位点的杀菌剂混用的策略, 可取得较好的延缓或克服抗药性的效果。(4)开发生物防治手段。 通过生物防治与化学防治相结合的方法, 可以在减缓病害发生的同时, 降低对化学药剂的使用量, 从而有效地延缓抗药性的发生。(5)抗性利用。 目前对抗性资源的利用主要集中在负交互抗性和抗性基因的利用上。 1987 年法国首先生产出N-苯基氨基甲酸酯类防治苯并咪唑抗性菌的制剂, 即diethofencarb和多菌灵混合剂,就是利用了负交互抗性用于防治葡萄灰霉(Botrytiscinerea)。Ishii等在研究V. nashicola的苯并咪唑抗性菌中, 发现高抗型对N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂和 N-phenylformamidoximes 化合物有负交互抗性, 可以加以利用, 而中低抗的利用应谨慎[25]。充分利用病原菌的抗性基因, 利用分子生物学技术改造生防菌, 通过抗性基因在生物防治菌中转化, 使化学防治与生物防治结合使用成为可能。 如杨谦等已经完成了 Saccharomyces cerevisiae 对多菌灵抗性基因在木霉菌(Trichoderma harzianum)中的转化, 转化后的木霉菌能在含 150 ug/mL 多菌灵的培养基上正常生长, 且其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10 代保持不变[26-28]。
4 展望
植物病原真菌杀菌剂抗药性研究要充分利用生物化学、 遗传学、 群体生物学等各学科的综合知识, 进一步加强交叉学科的分析研究, 来全面研究抗药性发生与流行、 抗药性机制、 抗性利用等等,最终为抗药性治理提供充分的依据。 加强培育抗病品种、 预测预报等综合防治措施, 对延缓抗药性的形成也是十分重要的。 此外随着生物技术的发展,对植物病原菌抗药性基因的利用已取得了初步的进展。 我们要持续推动化学防治与生物防治的结合,加速综合防治的发展。
参考文献(略)
 
采编:guoq
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