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果树分子标记研究进展
日期:2013-01-09 作者:张学宁, 郭保林, 张开春 来源:河北农业大学学报 点击:
 
果树童期长、树体大、多数农艺性状表现为数量性状且个体基因高度杂合,传统的研究方法受到很大的限制。遗传变异是生物的重要特性之一,它决定着生物的存在与发展,因此成为人类研究和改造的对象。近年来,果树学家通过研究植物的遗传特性,培育出了许多优良品种。分子生物学和分子遗传学的发展以及二者的互相渗透,给果树研究工作开辟了新的途径,基因转化和分子标记辅助选择育种成为培育更新、更好的栽培品种的有效手段。近年来,分子生物学的介入和分子标记技术的发展,对果树种质资源及遗传育种研究起到了巨大的推动作用。本文将重点综述果树分子标记研究的现状及以后的发展前景。
1 分子标记
分子标记是以生物大分子,尤其是生物体的遗传物质———核酸为基础的遗传标记。DNA分子标记是DNA在分子水平上遗传变异的直接反映,它们遗传稳定、信息量大,许多多态性标记在非编码区表现出选择“中性”,因而不受内外环境的影响,且具有与基因表达与否无关、检测迅速、操作简便等突出优点,因此,DNA分子标记成为最理想的遗传标记之一。目前,在果树中应用最多的是RFLP、RAPD、AFLP以及SCAR标记等。
2 分子标记在果树种质资源研究上的应用
2.1 种质资源的保存
种质资源的收集和保存是遗传育种工作的基础。果树具有种质丰富,品种多样的特点,但遗传资源的长期保存需要消耗巨大的人力物力。为了尽可能降低消耗,FRANKET(1984)与BROWN(1989)提出了核心种质的概念。利用核心种质(利用最小的群体来保存最完整的遗传信息)理论来长期保存种质资源,这就要求不但对种质的农艺性状进行研究,还要研究它们的遗传变异,避免重复、减少缺失。MCFERSON[1]认为分子标记可以用于核心种质的确定。核心种质的保存要求只能损失极少数绝对变异,而分子标记表现为中性,与植物适应性、产量等没有必然的联系,所以在确定种质时还要考虑与其他农艺性状结合,这样才能更准确。HOKANSON S.C[2]等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质。核心种质的提出可解决丰富的遗传资源材料的保存、评价、鉴定及利用带来的困难,并有利于管理、收集、种质创新及资源的深层次研究。
2.2 品种鉴定
果树栽培历史悠久,种间杂交、无性繁殖容易,个体差异不明显,同名异种现象普遍。用传统的形态和同工酶分析,误差大、效率低,难以鉴定性状相似的品种,分类标准也难以统一。DNA分子标记对品种的鉴定实质上是对基因型的鉴定,使果树品种鉴定和分类直接从DNA分子水平上进行,准确度高,效率高且信息量大。罗正荣等[3]用1个随机引物区分供试的15个柿品种,GRAHAM等[4]利用RAPD标记对10个红树莓品种进行RAPD分析,将其中的10个品种一一区别开。祝军等[5,6]应用AFLP技术区分了25个苹果品种,并用RAPD技术,以OPJ103为引物,区分了16个苹果品种,是迄今为止利用RAPD技术鉴定苹果品种效率较高的报道。品种鉴定可用于名称登记、专利保护及苗木纯度鉴定,对于保护新育成的品种及育种工作者的权益具有重要意义。
2.3 亲缘关系的演化及分类
在品种DNA指纹图谱建立的基础上对其进行聚类分析,可据此进行品种分类和亲缘关系的探讨。彭建营等[7]利用RAPD技术分析认为:永城长红与葫芦长红和躺枣亲缘关系较近;河北龙枣与山东龙枣为同物异名,由长红枣演化而来;山西龙枣与河北龙枣(山东龙枣)亲缘关系较远,故推测龙枣的起源为多元的。另外,彭建营等[8]利用RAPD技术对枣的64个品种及类型的遗传变异进行了研究,利用DNA扩增结果进行聚类分析,将供试的64个品种及类型分为8类,为更好的研究并利用这一珍贵的特色资源奠定基础。高志红[9]等利用RAPD技术对桃、梅、李、杏4种核果果树的代表品种进行RAPD扩增,获得了这几个树种的RAPD指纹图谱,聚类分析结果很好地反映了种间亲缘关系:梅和杏亲缘关系最近,桃次之,李最远,从而在基因水平上支持梅和杏为同一亚属,李、桃各为一亚属的分类方案。
2.4 系谱分析
果树中存在许多天然杂种,有些品种是经过实生选种或采用混合花粉杂交选育而成的。对这些品种用常规方法无法判断其父母本,系谱分析能提高育种亲本选配的准确程度以及果树资源的有效利用。NYBOM H[10]用RFLP技术准确地判断了3个苹果品种田间自然杂交后代幼苗的父本。苹果品种津轻母本是金冠,但父本不清。HARADA等[11]用RAPD结合RFLP分析表明,其父本为红玉。乔纳金和陆奥是2个三倍体品种,RAPD分析结果表明为二者提供2n配子的亲本为金冠,且它们分别来自金冠×红玉与金冠×印度。苹果品种Braeburn的亲本尚不清楚,GARDINER等[12]用同工酶、RAPD和RFLP结合的方法对16个品种进行了研究,推测Lady Hamilton最有可能是Braeburn的亲本之一。林伯年[13]等通过对杨梅属24个品种的材料进行RAPD分析,构建了新的系谱树状图,认为根据形态学确立的系谱关系需进一步研究。
2.5 遗传多样性分析
自然界的物种多种多样是由于遗传物质的多样性造成的。遗传多样性是生命系统的基本特征,也是物种适应自然和发生进化的遗传基础。基因型不同的品种或亲缘关系不同的物种,基因组内核苷酸系列存在差异。分子标记产物的多态性反映了被测材料的多样性。分子标记技术可以有效地检测种质资源的遗传多样性。在果树作物的系统演化、物种与品种的亲缘关系和分类方面应用分子标记技术,可以提供分子水平上的客观依据,并且比传统的方法更能反映其物种间的遗传多样性。目前应用于果树上的研究主要有以下两个方面:核心种质的筛选;群体遗传变异。杨新国等[14]利用RAPD技术对48个桃品种类型的遗传变异进行研究。经聚类分析将48个供试材料分为5类。从分子水平讨论了桃种质演化的分类地位,揭示了桃种质基因组部分类型间的DNA丰富的多态性。ROBERT等[15]用RAPD技术研究了胡桃属13个种41个类群的遗传多样性和系统发育。张开春等[16]运用RAPD技术证明了我国苹果无融合生殖资源平邑甜茶(Malus hupehensis)具有丰富的遗传多样性。GRAHAM等[17]在分析英、美、荷兰等国不同育种组培育出的草莓品种时发现其RAPD标记带型彼此虽有差别,但相似程度较高。这就提示育种者,在亲本选配时,要选择遗传距离较大的材料,有利于体现杂交优势。李荣旗[18]利用RAPD技术对7个山楂种24个栽培品种的亲缘关系、种质演化进行了研究,提出了栽培山楂多起源种间杂交演化的假说。
3 分子标记在果树遗传育种中的应用
3.1 分子遗传图谱的构建和基因的定位
基因标记就是筛选与目的基因连锁的遗传标记,通过对遗传重组交换结果进行连锁分析所得的基因标记或其他遗传标记在染色体上的相对位置的排列图叫遗传图谱(Genetic linkage map)。确定某一基因在染色体上的排列顺序叫基因定位。基因标记是构建遗传图谱、基因定位、克隆和分子辅助育种的前提。基因标记包括对数量性状和质量性状的标记。果树品种的改良往往只是希望个别性状的导入,只要寻找到与目的基因紧密连锁的标记即可。当然,如能找到控制单一性状的基因,其意义将会更大。目前,已有一批控制果树重要农艺性状(数量性状和质量性状)的基因被标记并得到广泛应用。分子标记数量是无限的,是构建遗传图的主要标记,现今的遗传图主要是分子遗传图。经典的遗传图谱(据形态、生理、和生化标记构建的)发展速度慢,图谱分辨率和饱和度不高,应用价值不高。分子遗传图谱的构建是根据多态DNA片段在分离群体中的分离情况直接观察统计而实现的。分子遗传图谱比传统的遗传图谱位点多、构建速度快、效率高且不受环境条件和发育条件的影响。随着分子标记的发展,遗传图谱己经达到了一定的密集程度,高密度的遗传图谱可为育种工作提供关于某个物种的完整而又详细的资料,使育种工作者很方便地找到与要研究的基因连锁的分子标记,并可把在遗传育种中发现的新标记定位于分子遗传图谱。此外,构建高密度的遗传图谱可为种质资源的保存和基因资源搜集的量化提供科学的依据。在苹果上,第1张完整的分子遗传图谱是由HEMMAT等[19]1994年发表的,但这张图谱是以RAPD标记为基础的,它不易在不同的群体间进行转换。LAWSON[20]等曾借助这张图分析了苹果枝条习性、萌芽、开花及吸收根形成的遗传基础,结果表明,发枝习性、萌芽时间、吸收根的产生主要受控于单一位点。另外,控制果皮花色素苷的基因也定位到了该图谱第3连锁群上。虽然后来也构建了许多连锁图谱,但仍是以RAPD技术显性标记为基础的,缺乏共显性标记。最新的苹果的遗传图谱是MALLIEPAURD[21]用分子标记及同工酶等多种等位基因标记构建的,该图谱具有较高的标记密度和共显性标记,是苹果上一张较为理想的参考图谱。
在桃上,1992—1998年已经报道了11张分子遗传图。一些桃的重要农艺性状如株型,果实有毛/无毛、酸/甜、黄肉/白肉、硬/软、粘离核、抗病基因等均已定位在该图谱上。其中株型基因(Pi)、果实黄肉基因(Y)、重瓣基因(DI)被定位在Rajabase等[22]构建的遗传图谱上。SOSINSKI等[23]用AFLP和RFLP构建了一张复合遗传连锁图谱,并将其上的标记转化为STSs,可直接用于分子辅助选择育种。目前,一些果树如葡萄、樱桃、杏、柑橘、柿、李等的初级分子遗传图谱已经构建,最有影响的是美国和欧洲实施的苹果和核果基因组计划。
3.2 分子标记辅助选择育种
在果树育种上,早期选择具有重要意义。分子标记辅助选择(Molecular marker assisted selection ,MAS)就是通过遗传标记对目标基因实施间接选择,对某些不期望性状也能及时发现和淘汰,可大大提高选择的准确性和提高育种效率。在果树育种中主要用于杂交亲本的选配、杂种实生苗的早期选择、染色体片段的去向追踪,基因检测、雌雄异株果树幼苗的性别鉴定以及多种抗病性状的直接筛选。这将大大加速育种进程,缩短育种年限,提高育种效率。在杂交育种方面,亲本的选配是关键环节,根据育种材料的表型特点选配亲本,往往受到环境条件的干扰,用分子标记技术对现有材料进行指纹图谱分析比较,结合其分子遗传图谱设计出能最大限度的综合利用有利基因和避免不利基因的最佳亲本组合,并计算出合理的杂交后代群体规模和选择强度。使亲本的选配更为准确、快速,从而提高育种效率。
对育种材料进行早期选择方面,根据分子遗传图谱和重要基因(如:抗病基因)的分子标记进行选择,可以实现早期鉴定。DAMACSO等[24]用SCAR标记对微繁香蕉Caverdish进行了早期检测。在葡萄抗病育种中,从幼苗中排除感霜霉病的后代具有重要意义。LUO SU-LAN等[25,26]将感霜霉病以及抗霜霉病的RAPD标记转化为SCAR标记,该SCAR标记可用于葡萄抗病育种中对杂种后代的抗霜霉病性和感霜霉病性进行早期鉴定,从而可提早去除感病性苗木,提高了育种效率,同时也降低了育种成本。他们还证明了该标记的通用性。田义轲[27]等将苹果柱型基因(Co)的AFLP标记转化为SCAR标记,发现该SCAR标记对苹果柱型性状检测的准确率达90%以上,可用于柱型苗木的早期鉴定及柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择。不少果树属雌雄异株,如银杏、猕猴桃、阿月浑子等,不同性别的果树具有不同的经济价值,果树性别的鉴定有重要意义。HORMAZA[28]应用RAPD技术对阿月浑子实生苗进行了早期性别鉴定,并且在猕猴桃上利用RAPD标记发现雌雄株间存在多态性。张立平等[29]利用RAPD技术分析雌雄异株葡萄的多态性。
4 存在问题及对策
分子标记在果树学研究中得到了广泛的应用,人们从自然界中获得、鉴定了很多的果树资源,并对这些资源进行合理的评价、保存和利用,为遗传高效育种奠定了一定的基础。随着果树分子标记的发展,果树学家也发现了不少问题:关于果树经济性状的标记报道较少,而对控制果树重要农艺性状的数量性状基因研究更少;遗传连锁图上标记间的距离大;采用的标记多为RAPD标记,然而RAPD标记本身并不稳定。鉴于以上问题,果树分子标记应加强以下几方面的研究:积极寻找与重要农艺性状连锁更为紧密的分子标记,注重数量性状的研究,加强QTL作图;提高分离群体的可靠性,多种分子标记研究,增加图谱的饱和度;开辟果树基因定位及功能鉴定新途径;研究亲本的起源进化关系,使亲本选配更符合育种目标,传统育种方法与分子标记相结合,加速培育果树新品种。
随着分子生物学的发展,分子标记与比较基因组学(Comparative genomics)、功能基因组学(Function genomics)和后基因组学(Post genomics)等学科的结合,分子标记将在果树品种改良、品种鉴定、资源创新,辅助选择育种等方面的应用具有广阔的发展前景,将大大缩短育种周期、加速育种进程。
参考文献:(略)
采编:guoq
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